本发明专利技术涉及分子印迹技术领域和电化学领域，具体公开了一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器及其制备方法和应用。以乳腺癌标志物CA 15‑3的抗原决定基七肽PDTRPAP为模板分子，通过电聚合技术在玻碳电极上原位制备分子印迹聚合物膜，当把模板分子洗脱后，所得到的分子印迹电化学传感器不仅可以识别PDTRPAP，而且可以识别以PDTRPAP为抗原决定基的乳腺癌标志物癌抗原(CA15‑3)。
A Molecularly Imprinted Electrochemical Sensor Based on Antigen Decision Base Method and Its Preparation and Application
The invention relates to the field of molecular imprinting technology and electrochemistry, in particular to a Molecularly Imprinted Electrochemical Sensor Based on antigen determinant method, its preparation method and application. Molecularly imprinted polymer membranes were prepared in situ on glassy carbon electrodes using the antigenic determinant heptapeptide PDTRPAP of breast cancer marker CA 15 3 as template molecule. When the template molecule was eluted, the obtained Molecular Imprinted Electrochemical sensor could not only recognize PDTRPAP, but also recognize breast cancer marker antigen (CA15 3) with PDTRPAP as antigen determinant.
【技术实现步骤摘要】
一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器及其制备方法和应用
本专利技术涉及分子印迹
和电化学领域，研制了一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器。以乳腺癌标志物CA15-3的抗原决定基七肽脯氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-精氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸（Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro，PDTRPAP）为模板分子，通过电聚合技术在玻碳电极上原位制备分子印迹聚合物膜，当把模板分子洗脱后，所得到的分子印迹电化学传感器不仅可以识别PDTRPAP，而且可以识别以PDTRPAP为抗原决定基的乳腺癌标志物癌抗原(CA15-3)。
技术介绍
乳腺癌是三大最常见肿瘤之一，目前临床应用最广泛的、与乳腺癌相关的肿瘤标志物是粘蛋白（mucin）MUC-1抗原。MUC-1抗原是一种粘蛋白类的糖蛋白，MUC-1乳腺癌粘蛋白（cancerantigen15-3,CA15-3抗原）由瘤细胞分泌，可作为作乳腺癌的血清学标志物。目前临床分析CA15-3主要采用酶联免疫吸附分析法（ELISA）和放射免疫分析法（RIA）。ELISA需要采用辣根过氧化物酶（HRP）标记CA15-3抗体，技术要求较高，试剂昂贵，如专利号CN1773284，专利名称为：一种人血清乳腺癌特异抗原检测酶联免疫吸附试剂盒，该专利研制了人血清乳腺癌特异抗原检测酶联免疫吸附试剂盒，该试剂盒是通过ELISA试验，检测人血清中相应抗原BRCAA1与特异抗原表位SSKQKRSHK的微量诊断方法，用于检测人血清中的乳腺癌抗原，在实验中需要采用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶标记CA15-3抗体。RIA通常需要采用放射性元素，不仅废物难以处理，对化验员身体也非常有害。此外还有应用电阻抗扫描成像检测仪对乳腺癌进行筛查的专利，如申请号为200420041746的专利，该专利技术名称为：一种用于乳腺癌早期普查的电阻抗扫描成像检测仪，仪器较为复杂。拉曼光谱检测方法也已经用于乳腺癌早期诊断，如申请号为200510036931的专利，其专利技术名称为：一种利用毛发实现乳腺癌早期诊断的拉曼光谱检测方法，该专利技术选取妇女自然白化的毛发，采用近红外激光对毛发进行照射，激发毛发的拉曼光谱，将获得的拉曼光谱与正常人毛发的拉曼光谱作比较，确定两者差异的特征谱线。该专利技术判断是否是乳癌的主要依据是拉曼光谱，该方法可以对乳癌进行早期诊断。从有关乳腺癌的专利检索中可以看出，尽管已经有多种研究手段对乳腺癌标志物进行识别与检测，但是分子印迹聚合物的优势在其中并未得到真正的发挥。抗原决定簇法是种新的印迹方法，其原理是抗体识别抗原时，抗体只与抗原决定簇相作用,因此具有相同决定簇的抗原可以被同一种抗体识别。该法是采用与蛋白质结构中暴露在表面的肽链(抗原决定簇)相同的短肽作为印迹分子,得到的大孔MIP不仅可识别该肽,也可以识别整个蛋白质分子。此法从经济的角度来看很有潜力，因为小肽分子通常都比较便宜,并且可以选用比相应蛋白大分子多得多的功能单体。这一方法为高效合成对蛋白质具有高选择性的吸附剂和受体拓宽了思路。在中国专利网以“抗原决定基”对专利名称进行检索，可以查到8项专利；在中国专利网以“抗原决定簇”对专利名称进行检索，可以查到41项专利；以“抗原决定基（或抗原决定簇）”和“分子印迹”为专利名称组合检索，未查到相关专利。本专利技术提出了一种基于分子印迹抗原决定基法识别乳腺癌标志物的思路。以结构上与乳腺癌标志物CA15-3的活性位点结构类似的七肽PDTRPAP为印迹分子，其关键在于当把七肽洗脱后，所得到的分子印迹聚合物不仅可以识别PDTRPAP，而且可以识别以PDTRPAP为抗原决定基的乳腺癌标志物CA15-3。
技术实现思路
从相关专利检索可以看出，分子印迹电化学传感器已经广泛的应用于小分子物质的检测，但仍未见有在玻碳电极上以抗原决定基作为模板分子合成分子印迹聚合物膜并应用于识别相应的大分子抗原的专利。本专利技术的一个目的是提供一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器；本专利技术的另一个目的是提供上述分子印迹电化学传感器的制备方法；本专利技术的再一个目的是提供分子印迹电化学传感在检测乳腺癌标志物CA15-3中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供了一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器的制备方法：在玻碳电极表面修饰羧基化多壁碳纳米管后，采用乳腺癌标志物癌抗原CA15-3的抗原决定基七肽脯氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-精氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸（Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro，PDTRPAP）为模板分子，邻氨基苯酚为功能单体，采用电化学聚合技术原位合成包含模板分子PDTRPAP的聚合物膜，当把模板分子洗脱后，由于抗原抗体的识别主要在于抗原决定基，得到的印迹空穴不仅可以识别PDTRPAP，而且可以识别以PDTRPAP为抗原决定簇的乳腺癌标志物CA15-3。当印迹空穴物与CA15-3重新识别后，电极表面的绝缘程度变大，电化学探针K3[Fe(CN)6]在电极表面的穿透性变差，通过电化学探针K3[Fe(CN)6]在电极表面的电流变化实现CA15-3的间接测定，该分子印迹电化学传感器识别原理见图1。本专利技术提供了一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器的制备方法，具体包括如下步骤：（1）玻碳电极的预处理：将玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm和0.05μm的抛光粉（Al2O3）抛光，然后依次用体积比1:1乙醇和蒸馏水超声清洗。将清洗后的电极用高纯氮气吹干，在1mmol/LK3[Fe(CN)6]（支持电解质：0.1mol/LKCl，50mmol/LPBS）记录循环伏安曲线，直至得到可逆的氧化还原曲线（峰电位差小于90mV，氧化峰电流与还原峰电流之比约为1：1）；（2）羧基化多壁碳纳米管修饰的玻碳电极MGCE的制备：称取0.5g的多壁碳纳米管（MWCNTs），加入100mL浓硝酸，在120℃条件下冷凝回流4h，待冷却至室温后，抽滤并用蒸馏水洗涤直至中性。将所得黑色固体放在真空干燥箱中干燥至恒重，得到羧基化的多壁碳纳米管，记为MWCNTs-COOH。酸处理后的碳纳米管表面不仅引入了羧基，而且还引入了大量的羟基，可以提高碳纳米管的分散性，增强其与模板分子之间的相互作用。将10mgMWCNTs-COOH加入10mLN，N-二甲基甲酰胺，然后超声形成均一的分散液。移取9μL的分散液涂在玻碳电极上面，在室温下自然干燥，所得电极为MGCE（图2为MGCE的扫描电镜图）。（3）分子印迹聚合物膜的制备：以MGCE电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，以含5.0mmol/L邻氨基苯酚和0.1mmol/LPDTRPAP的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.0，50mmol/L)为聚合液，首先往溶液中通入高纯氮气10min,设置扫描速度为50mV/s，电位范围为-0.5~1.0V时，循环扫描，聚合20圈即得到嵌有PDTRPAP的聚氨基苯酚多壁碳纳米管玻碳电极。碳纳米管修饰电极和裸电极的聚合曲线见附图3。其中，图3中的A为邻氨基苯酚在MGCE的电聚合曲线;图3中的B为邻氨基苯酚在裸电极上的电聚合曲线。在图3中的A可以看出，邻氨基苯酚在碳纳米管修饰电极上具有更高的初始峰电流，表明MWCNTs-C本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，在玻碳电极表面修饰羧基化多壁碳纳米管后，以乳腺癌标志物癌抗原CA 15‑3的抗原决定基七肽脯氨酸‑天冬氨酸‑苏氨酸‑精氨酸‑脯氨酸‑丙氨酸‑脯氨酸PDTRPAP为模板分子，通过电聚合技术在修饰后的玻碳电极上原位制备分子印迹聚合物膜，把模板分子洗脱后，得到分子印迹电化学传感器。
【技术特征摘要】
1.一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，在玻碳电极表面修饰羧基化多壁碳纳米管后，以乳腺癌标志物癌抗原CA15-3的抗原决定基七肽脯氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-精氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸PDTRPAP为模板分子，通过电聚合技术在修饰后的玻碳电极上原位制备分子印迹聚合物膜，把模板分子洗脱后，得到分子印迹电化学传感器。2.如权利要求1所述的基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）将羧基化的多壁碳纳米管分散到N，N-二甲基甲酰胺中，然后超声形成1mg/mL的均一的分散液，移取分散液滴涂在玻碳电极上面，在室温下自然干燥，得到羧基化多壁碳纳米管修饰电极MGCE；（2）以MGCE电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，以含5.0mmol/L邻氨基苯酚和0.1mmol/LPDTRPAP的磷酸盐缓冲溶液为聚合液，在聚合液中先通入高纯氮气10分钟，选择扫描速度为50mV/s，电位范围为-0.5...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭友元，
申请(专利权)人：泉州师范学院，
类型：发明
国别省市：福建,35
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。