一种检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于滚环扩增介导催化发夹自组装和内切酶反馈放大方法检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器。该发明专利技术的检测方式是荧光法检测，利用荧光仪。在检测之前，先将挂锁探针和连接探针形成环形模板探针。然后将目标物加入到复合探针I、复合探针II和HP2、HP3的均相溶液，在37℃孵育120min，目标物与适配体序列绑定。在phi29 DNA聚合酶和核酸内切酶IV作用下完成多倍数反馈放大过程，从而实现信号的放大。然后用荧光仪设置激发波长为399 nm，检测610 nm处荧光强度，检测范围为560 nm‑640 nm。同时本发明专利技术还提供了该生物传感器的制备方法，该方法反应条件温和，易于操作。

A fluorescent biosensor for detection of ochratoxin A and its preparation method and Application

The invention relates to the technical field of biosensors, in particular to a fluorescent biosensor for detecting ochratoxin A based on self-assembly of roll amplification mediated catalytic hairpin and feedback amplification of endonuclease. The detection method of the invention is fluorescence detection, using fluorescence meter. Before detection, the padlock probe and the connection probe are formed into a ring template probe. Then the target was added to the homogeneous solution of compound probe I, compound probe II and HP2, HP3, incubated at 37 ~C for 120 min, and the target was bound to the aptamer sequence. Under the action of phi29 DNA polymerase and nucleic acid endonuclease IV, the process of multiplier feedback amplification is completed to amplify the signal. Then, the excitation wavelength was set to 399 nm by fluorescence meter, and the fluorescence intensity at 610 nm was measured. The detection range was 560 nm 640 nm. The invention also provides a preparation method of the biosensor, which has mild reaction conditions and is easy to operate.

【技术实现步骤摘要】
一种检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物传感器
，特别涉及基于滚环扩增介导催化发夹自组装和内切酶反馈放大方法检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器，还涉及其制备方法。
技术介绍
赭曲霉毒素（Ochratoxins，OT）是由曲霉菌、青霉菌等菌属产生的一类低分子量的次级代谢产物，属于真菌毒素组的天然污染物。其在农作物生产、加工、储存等过程中均能存在，其中，赭曲霉毒素A（OchratoxinA，OTA）是毒性最强、分布最广的一类，20世纪60年代在南非的玉米粉中被发现。多项研究表明，OTA具有肾毒性、肝毒性、胚胎毒性、致畸形、神经毒性、免疫毒性、遗传毒性和致癌性。国际癌症研究机构（IARC）根据几项动物研究中发现的大量致癌性证据，将OTA列为可能的人类致癌物（2B类）。此外，联合国粮农组织（FAO）估计，世界上约有25%的谷物受到霉菌毒素的污染。由于OTA具有痕量、剧毒、污染情形较复杂等特点，使实际检测存在较大难度，建立灵敏、高效的检测方法对于研究OTA的污染状况、有效降低其危害及制定各种实际样品中OTA的限量标准具有重要意义。传统的检测OTA的方法主要有：光学分析法、电泳法、色谱法。但存在以下缺点：检测精度相对较低；检测时间较长，操作复杂；检测仪器昂贵，成本高。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中检测赭曲霉毒素A（OTA）的方法特异性和灵敏度都比较低、检测周期长的问题，本专利技术提供了一种特异性和灵敏度高、检测速度快的基于滚环扩增介导催化发夹自组装和内切酶反馈放大方法检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器。同时还提供了该荧光生物传感器的制备方法。一种检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器，包括OTA适配体、目标物、复合探针I、复合探针II、HP2、HP3、phi29DNA聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP以及缓冲液；所述复合探针I为OTA适配体、拱形探针与环形模板杂交而成；所述复合探针II为环形模板与HP1杂交而成；所述的环形模板探针由挂锁探针与连接探针形成；所述的挂锁探针序列如SEQNo.1所示；所述的连接探针序列如SEQNo.2所示；所述的OTA适配体序列如SEQNo.3所示；所述的拱形探针序列如SEQNo.4所示所述的HP1序列如SEQNo.5所示；所述的HP2序列如SEQNo.6所示；所述的HP3序列如SEQNo.7所示。所述的挂锁探针的5'端磷酸化。所述的环形模板探针的制备工艺为：S1挂锁探针、连接探针在10×T4DNA连接酶反应缓冲液中变性；所述的缓冲液为50mMTris-HCl，10mMMgCl2，10mMDTT，1mMOTA，pH7.5；S2加入3μL400U/μLT4DNA连接酶，并在20℃孵育2h；S3在65℃热处理10分钟使T4DNA连接酶失活，同时使连接反应液终止；S4加入核酸外切酶Ⅰ、核酸外切酶Ⅲ，在37℃水浴反应1h，然后热处理使外切酶失活，4℃保存待用。所述复合探针I的制备工艺为：将灭菌水、环形模板、archprobe、OTAaptamer、PBS缓冲液，在37℃孵育，使环形模板与探针链充分杂交，制备成复合探针I。所述复合探针II的制备工艺为：环形模板、HP1、PBS缓冲液，在37℃孵育，使环形模板与探针链充分杂交，制备成复合探针II。上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）NMM溶液配制；所述的NMM为N-methylmesoporphyrinIX的缩写，称取NMM粉末0.0009g，溶于90μL二甲基亚砜中，于-20℃保存；（2）将目标物与复合探针I、复合探针II、HP2、HP3、NMM溶液、phi29DNA聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP加入缓冲液中，混合均匀；37℃，孵育120min；（3）荧光检测；激发波长设置为399nm，发射波长为610nm，检测范围560nm-640nm，读取荧光信号变化。所述的步骤（2）的缓冲液为50mMTris-HCl,10mMMgCl2,10mM(NH4)2SO4,4mMDTT,pH7.5。该专利技术的检测方式是荧光法检测，利用荧光仪。在检测之前，先将挂锁探针和连接探针形成环形模板探针。然后将目标物加入到复合探针I、复合探针II和HP2、HP3的均相溶液，在37℃孵育120min，目标物与适配体序列绑定。在phi29DNA聚合酶和核酸内切酶IV作用下完成多倍数反馈放大过程，从而实现信号的放大。然后用荧光仪设置激发波长为399nm，检测610nm处荧光强度，检测范围为560nm-640nm。本专利技术基于核酸适配体探针与目标物赭曲霉毒素A的特异性识别，phi29DNA聚合酶展示了两种不同功能：外切酶活性及聚合复制延伸活性。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补OTA现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。本专利技术中一共用到了7条DNA链，其序列分别是：OTA适配体（S1）:GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACATTTTTT-InverteddT拱形探针（S2）:GATATCAGCGATGGCCGATGCTTTTTTTCACCCGATC挂锁探针padlockprobe:P-CTGATATCCGTCCCTTTGGGTAGGGAGAGACTGGACGTCCCTTTGGGTAGGGAGAGACTGGACCATCG连接探针:ACGGATATCAGCGATGGTCCAGTHP1:GATATCAGCGATGGGTAXCGGCTTGAGATGTTAGGGACGAGTGCGCACTCCACAAGGCACTCGTCCCTGGGTGGGT-inverteddTHP2:GGGTGGGTCTTGTGGAGTGCGCTTGAGATGTTGCACTCGTCCCTAACATCTCAAGCCGTTACTTTTTT-inverteddTHP3:GGGTGGGTAGGGACGAGTGCCTTGTGGAGTGCGCACGTGCAACATCTCAAGCGCACTCCACAAGGGGTGGGT-inverteddT其中斜体的部分则是不同探针与环形模板的杂交序列，3’端修饰的InverteddT即反向dT用于抑制降解作用。在padlockprobe中的p表示一个5’磷酸基团的修饰，用于在T4DNA连接酶的作用下，与3’端的羟基形成磷酸二酯键，构成环形模板。发夹探针（HP1、HP2、HP3）中下划线表示自杂交形成发夹的茎端，加粗部分代表能够形成G四联体的两段序列，在反应体系中通过邻近，使两段序列靠近形成G四联体。此外，HP1中X表示无嘌呤无嘧啶位点（AP位点）。本专利技术中OTA的检测是在均相溶液中实现的，通过phi29DNA聚合酶、核酸内切酶IV的配合实现双重信号放大，从而实现OTA的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。（二）均相中发生的反应主要有：环形模板及复合物探针的制备；适配体与目标物OTA的识别过程；滚环扩增介导催化发夹自组装及内切酶反馈信号放大反应。（1）环形模板及复合探针的制备。线性挂锁探针与连接探针结合，在T4DNA连接酶的作用下，形成环形模板-连接引物的复合体，当有核酸外切酶I和外切酶III存在时，对引物进行消化，从而形成环形模板备用。archprobe能够与制备好的环状模板通过碱基互本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器，其特征在于，包括OTA适配体、目标物、复合探针I、复合探针II、HP2、HP3、phi29 DNA 聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP以及缓冲液；所述复合探针I为OTA适配体、拱形探针与环形模板杂交而成；所述复合探针II为环形模板与HP1杂交而成；所述的环形模板探针由挂锁探针与连接探针形成；所述的挂锁探针序列如SEQ No.1所示；所述的连接探针序列如SEQ No.2所示；所述的OTA适配体序列如SEQ No.3所示；所述的拱形探针序列如SEQ No.4所示所述的HP1序列如SEQ No.5所示；所述的HP2序列如SEQ No.6所示；所述的HP3序列如SEQ No.7所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测赭曲霉毒素A的荧光生物传感器，其特征在于，包括OTA适配体、目标物、复合探针I、复合探针II、HP2、HP3、phi29DNA聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP以及缓冲液；所述复合探针I为OTA适配体、拱形探针与环形模板杂交而成；所述复合探针II为环形模板与HP1杂交而成；所述的环形模板探针由挂锁探针与连接探针形成；所述的挂锁探针序列如SEQNo.1所示；所述的连接探针序列如SEQNo.2所示；所述的OTA适配体序列如SEQNo.3所示；所述的拱形探针序列如SEQNo.4所示所述的HP1序列如SEQNo.5所示；所述的HP2序列如SEQNo.6所示；所述的HP3序列如SEQNo.7所示。2.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述的挂锁探针的5'端磷酸化。3.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述的环形模板探针的制备工艺为：S1挂锁探针、连接探针在10×T4DNA连接酶反应缓冲液中变性；所述的缓冲液为50mMTris-HCl，10mMMgCl2，10mMDTT，1mMOTA，pH7.5；S2加入3μL400U/μLT4DNA连接酶，并在20℃孵育2h；S3在65℃热处理10分钟使T4DNA连接酶失活，同时使连接反应液终止；S4加入核酸外切酶Ⅰ、核酸外切酶Ⅲ，在37℃水浴反应1h，然后热处理使外切酶失活，4℃保存待用。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄加栋，王敬锋，王玉，刘素，王海旺，宋晓蕾，张雪，赵一菡，瞿晓南，张儒峰，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37