一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物及试剂盒，属于生物技术领域，所述套式PCR引物包括：(1)外套引物，包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物；(2)内套引物，包括SEQ ID No.3所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID No.4所示核苷酸序列的下游引物。本发明专利技术还提供包含上述套式PCR引物的试剂盒。本发明专利技术提供的套式PCR引物及试剂盒用于检测猪急性腹泻冠状病毒，兼具高灵敏度、便捷性和特异性强的优点。

A set of PCR primers and kits for detection of swine acute diarrhea coronavirus

The invention relates to a set of PCR primers and kits for detecting porcine acute diarrhea coronavirus, belonging to the field of biotechnology. The nested PCR primers include: (1) primers containing primers, including upstream primers of nucleotide sequences shown by SEQ ID No.1 and downstream primers of nucleotide sequences shown by SEQ ID No.2; (2) internal primers, including upstream indications of nucleotide sequences of SEQ ID No.3. The downstream primers of the nucleotide sequence shown in SEQ ID No.4. The invention also provides a kit containing the above nested PCR primers. The sleeve type PCR primers and kits are used to detect porcine acute diarrhea coronavirus, and have the advantages of high sensitivity, convenience and specificity.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物及试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物及试剂盒。
技术介绍
2017年2月，在广东的腹泻哺乳仔猪中分离到一种新现的类似蝙蝠-HKU2的猪急性腹泻冠状病毒(又称猪肠溶性alpha冠状病毒，SADS-CoV)，这种猪急性腹泻冠状病毒引起的临床症状与其他冠状病毒如猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒等引起的腹泻症状非常相似，以水样腹泻为主要特征。这是从猪群中发现的第五种冠状病毒，与之前发现的引起猪腹泻的冠状病毒(传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒)类似，SADS-CoV引起的疾病可致新生哺乳仔猪急性剧烈水样腹泻，死亡率可达100％。因此，SADS-CoV引起的腹泻对当前生猪生产造成非常严重的危害，也是困扰养殖业中的难题之一。随着我国养殖业不断走向现代化养殖模式的超大规模化养殖场，新病原的发现和爆发频率高，给养猪业造成巨大经济损失，对养殖业是巨大的挑战。目前，SADS-CoV的诊断方法还不健全，主要依靠常规PCR、荧光定量PCR和病毒分离等诊断手段。套式PCR是在常规PCR的基础上发展起来的，不仅保留常规PCR的优点，同时还较大的提高了检测的灵敏性、特异性和重复性。此外，套式PCR需要的仪器设备和对人员技术要求不需要荧光定量PCR的高，可以在临床上大面积推广和使用。因此，建立猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测引物组及试剂盒十分必要。本专利技术根据猪急性腹泻冠状病毒的N基因设计引物组，可用于建立高效、准确、快速的分子生物学诊断技术。
技术实现思路
针对现有技术的不足之处，本专利技术的目的在于提供一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物及试剂盒，本专利技术提供的套式PCR引物及试剂盒用于检测猪急性腹泻冠状病毒，兼顾高灵敏度、便捷性、特异性强的优点。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的技术方案之一是提供一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物，其包括如下引物：(1)外套引物，包括SEQIDNo.1所示核苷酸序列的上游引物和SEQIDNo.2所示核苷酸序列的下游引物；(2)内套引物，包括SEQIDNo.3所示核苷酸序列的上游引物和SEQIDNo.4所示核苷酸序列的下游引物。其中，该外套引物扩增的DNA片段大小为650bp，其核苷酸序列序列如SEQID:No.5所示。该内套引物扩增的DNA片段大小为291bp，其核苷酸序列如SEQID:No.6所示。本专利技术的技术方案之二是提供一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的试剂盒，其包括如前所述的套式PCR引物。在本专利技术中，所述试剂盒还包括反转录试剂。优选地，所述的试剂盒，其包括：(1)反转录试剂：MgCl2、缓冲液、dNTPmix、RNA酶抑制剂、反转录酶、随机引物和灭菌双蒸水；(2)套式PCR试剂：外套PCR预混液：DNA聚合酶、缓冲液、权利要求1所述的外套引物和灭菌双蒸水；内套PCR预混液：DNA聚合酶、缓冲液、权利要求1所述的内套引物和灭菌双蒸水。在本专利技术提供的较佳实施例中，所述反转录试剂包括：25mM/μLMgCl22μL、5×Buffer4μL、10mM/μLdNTPmix2μL、40UI/μLRNA酶抑制剂0.5μL、200UI/μL反转录酶M-MLV1μL、20mM/μL随机引物2μL和灭菌双蒸水6μL。本专利技术中，所述反转录配套的反应程序为：42℃50min；95℃5min。本专利技术提供的较佳实施例中，所述外套PCR预混液包括：2U/μL聚合酶TaKaRaExTaq0.3μL、10×ExTaqBuffer2.5μL、2.5mM/μLdNTPmix1μL、10mM/μL所述外套引物各1μL和灭菌双蒸水16.7μL。本专利技术中，所述外套PCR配套的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行20个循环；72℃再延伸7min。本专利技术提供的较佳实施例中，所述内套PCR预混液包括：2U/μL聚合酶TaKaRaExTaq0.3μL、10×ExTaqBuffer2.5μL、2.5mM/μLdNTPmix1μL、10mM/μL权利要求1所述内套引物各1μL和灭菌双蒸水16.7μL。本专利技术中，所述外套PCR配套的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，进行20个循环；72℃再延伸7min。本申请还提供利用上述引物检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR方法，所述的套式PCR方法分三步进行，提取病毒RNA后，首先按照大连宝生物公司(TaKaRa)的反转录试剂盒说明书反转录成cDNA，然后以第一步得到的cDNA为模板，用外套引物进行扩增；最后以第二步扩增的产物为模板用内套引物进行扩增。反转录反应体系，在20μL体系中加入以下成份：反转录的反应条件为：42℃50min，95℃5min。反转录完成后，cDNA直接用于PCR扩增或者置于-20℃保存。在本专利技术实施例中，所述猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测的反应体系为25μL，反应体系包括：外套PCR反应体系条件：反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行20个循环；72℃再延伸7min。内套PCR反应体系条件：反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，进行20个循环；72℃再延伸7min。本专利技术的检测猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测引物可用于非诊断目的的检测试剂盒。所述的在试剂盒中的应用，是将所述的引物作为核心检测试剂，配合其他常用试剂(按常规方法)可以用于上述猪急性腹泻冠状病毒的试剂盒，所述的试剂盒的组装参照常规方法组装和配制。与现有技术相比，本专利技术较佳实施例具有如下有益效果：本专利技术提供的套式PCR引物用于检测猪急性腹泻冠状病毒，兼顾灵敏度、便捷性、特异性，其最低检测浓度达到1.0×102拷贝/μL。本专利技术提供的试剂盒具有成本低，检测速度快和结果易于判断等优点，能够快速、准确地鉴定猪急性腹泻冠状病毒感染情况，具有很好的应用前景。附图说明图1为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR外套引物扩增产物电泳图；附图标记说明：1、2、3、4为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR外套引物扩增的大小约为650bp的片段，Maker：DNAMarkerDL2000；图2为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR内套引物扩增产物电泳图；附图标记说明：1、2、3、4为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR内引物扩增的大小约为291bp的片段，Maker：DNAMarkerDL2000；图3为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR特异性试验结果电泳图。附图标记说明：1：SADS-CoV外套PCR扩增产物；2：SADS-CoV内套PCR扩增产物；3：SADS-CoV套式PCR扩增产物；4-6自左向右依次为：PEDV、TGEV、PDCoV的扩增产物；Maker：DNAMarkerDL2000；图4为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR敏感性试验结果电泳图；附图标记说明：1-8自左向右依次为：1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物，其特征在于，其包括如下引物：(1)外套引物，包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物；(2)内套引物，包括SEQ ID No.3所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID No.4所示核苷酸序列的下游引物。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物，其特征在于，其包括如下引物：(1)外套引物，包括SEQIDNo.1所示核苷酸序列的上游引物和SEQIDNo.2所示核苷酸序列的下游引物；(2)内套引物，包括SEQIDNo.3所示核苷酸序列的上游引物和SEQIDNo.4所示核苷酸序列的下游引物。2.一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的套式PCR引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反转录试剂。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，其包括：(1)反转录试剂：MgCl2、缓冲液、dNTPmix、RNA酶抑制剂、反转录酶、随机引物和灭菌双蒸水；(2)套式PCR试剂：外套PCR预混液：DNA聚合酶、缓冲液、权利要求1所述的外套引物和灭菌双蒸水；内套PCR预混液：DNA聚合酶、缓冲液、权利要求1所述的内套引物和灭菌双蒸水。5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录试剂包括：25mM/μLMgCl22μL、5×Buffer4μL、10mM/μLdNTPmix2μL、40UI/μLRNA酶抑制剂0.5μL、200UI/μL反转录酶M-MLV1μL、20mM/μL随机...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋德平，张誉翰，张帆帆，袁为锋，唐玉新，李凯，叶昱，丁珍，吴琼，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：江西,36