一种烟草砷转运基因NtNIP7-1的克隆方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种烟草砷转运基因NtNIP7‑1及其克隆方法与应用，烟草砷转运基因NtNIP7‑1核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本发明专利技术还公开了烟草砷转运基因NtNIP7‑1的克隆方法，具体步骤包括：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；以反转录得到的第一链cDNA作为模板，根据NtNIP7‑1基因序列设计合成特异性引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。本发明专利技术中，在烟草植株内抑制烟草内源基因NtNIP7‑1的表达，会使烟草烟叶的砷含量明显降低，在植物低砷含量育种领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

Cloning and application of arsenic transporter gene NtNIP7-1 in tobacco

The invention discloses a tobacco arsenic transporter gene NtNIP7_1 and its cloning method and application. The nucleotide sequence of the tobacco arsenic transporter gene NtNIP7_1 is shown as SEQ ID:No.1, and the encoded amino acid sequence is shown as SEQ ID:No.2. The invention also discloses the cloning method of tobacco arsenic transporter gene NtNIP7 1, which includes: extracting tobacco RNA and retranscribing to obtain the first chain of DNA; using the first chain of DNA retranscribed as template, designing and synthesizing specific primers according to the sequence of NtNIP7 1 gene, carrying out PCR amplification, recovering and purifying the amplified products of PCR, and sequencing. In the invention, inhibiting the expression of the endogenous gene NtNIP7 1 in the tobacco plant can significantly reduce the arsenic content of tobacco leaves, and has broad application prospects in the field of plant breeding with low arsenic content, with huge economic benefits potential.

【技术实现步骤摘要】
一种烟草砷转运基因NtNIP7-1的克隆方法与应用
本专利技术属于遗传工程
，具体涉及一种烟草砷转运基因NtNIP7-1的克隆方法与应用。
技术介绍
砷在自然界中广泛存在，是地壳中含量最丰富的元素之一，平均浓度接近3mgkg-1(CullenandReimer,1989)。通常情况下，砷通过自然反应和人为作用释放到环境中，例如火山排放、岩石风化、温泉释放、采矿、冶炼以及含砷的农药、除草剂，木材防腐剂和饲料添加剂的使用等(Zhaoetal.，2010b)。目前，砷污染已然成为一个全球性的问题，主要涉及食物、空气、水体及土壤污染等方面。无机砷属于人类一级致癌物质，水体和食物为主要的砷污染来源（Smithetal.，2002;Tsujietal.，2007)。报道显示有70多个国家的地下水受到砷的污染，对全世界约1亿5千万人的身体健康产生严重的危害，这些人中大约1亿1千万人来自于亚洲的十个国家，目前中国是仅次于孟加拉的砷污染第二严重的国家。砷的毒性强度与存在形式有关，无机砷的毒性高于有机砷，无机砷中亚砷酸盐的毒性高于砷酸盐，但是当有机砷中的五价单甲基砷酸盐(MMA)和二甲基砷酸盐(DMA)还原成三价时，毒性会显著提高(Stybloetal.，2000)。砷对动植物的危害是巨大的，浓度超过一定的范围甚至会使植物致死。例如长期暴露在砷环境下的植物会导致光合作用受阻，生长发育受到抑制，同时也会引起谷粒的减产(JainandGadre,1997)。人体在砷中毒后可能导致皮肤、消化系统、神经系统、呼吸系统、心血管系统等疾病(Kalaetal.，2000;Maoetal.，2010)。烟草是重要的经济作物，在中国境内广泛的种植。如果烟草种植在砷含量比较高的土壤中能够对砷进行富集，而一旦烟草对砷元素富集后，再加工成卷烟制品，就可能危害到消费者的身体健康。因此在烟草种植过程中需解决砷含量过高的问题，而通过农艺方法很难降低烟草中的砷含量。因此采用基因工程的方法对烟草进行基因改良从而降低砷含量是一种更为有效的办法。NIP7-1基因在之前在其它物种中具有吸收砷的功能，但是在烟草中的功能尚未有人报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种烟草砷转运基因NtNIP7-1；第二目的在于提供所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的应用。本专利技术的第一目的是这样实现的，所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。本专利技术的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；B、NtNIP7-1基因的PCR扩增：以反转录得到的第一链cDNA作为模板，根据NtNIP7-1基因序列设计合成特异性引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。本专利技术的第三目的是这样实现的，所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1在获得低砷转基因植株中的应用。本专利技术的第四目的是这样实现的，所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1应用所得到的烟草品种及其种子和无性繁殖体。本专利技术的第五目的是这样实现的，所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的表达盒。本专利技术的第六目的是这样实现的，所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的转基因细胞系。本专利技术的第七目的是这样实现的，所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的重组菌。NtNIP7-1基因在烟草中为一个基因家族，具有多个同源基因，同时烟草中的NtNIP7-1基因的同源性与其它作物相比较低，因此确定那个基因在烟草中具有吸收砷的功能是十分重要的。本专利技术在烟草中降低NtNIP7-1基因的表达量可以显著降低烟草中砷含量，因此该基因可以应用于低砷植物品种的育种，具有极大的应用前景与价值。本专利技术所述的烟草砷转运蛋白基因NtNIP7-1编码一种转运砷离子的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列如SEQID：No.2所示。所述多肽还可能为由SEQIDNo：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成，且具有吸收砷离子功能的衍生多肽。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。本专利技术所述烟草砷转运蛋白基因NtNIP7-1包含的核苷酸序列如SEQID：No.1所示。或者在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；或者与序列表中SEQIDNo：1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本专利技术所述烟草砷转运蛋白基因NtNIP7-1的应用为在烟草植株体内抑制所述NtNIP7-1基因的表达，可降低烟草中砷的含量。可通过由RNA介导的多种方法抑制NtNIP7-1基因的表达，如：植物病毒载体介导基因沉默的方法、农杆菌介导转化RNAi干扰载体、优化修改基因编码匡、优化基因启动子等方法。本专利技术所述的抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制NtNIP7-1表达即可。本专利技术的烟草砷转运蛋白基因NtNIP7-1及其编码基因为农作物尤其是烟草低砷含量育种提供基因与技术的支持。本专利技术中，在烟草植株内抑制烟草内源基因NtNIP7-1的表达，会使烟草烟叶的砷含量明显降低，在植物低砷含量育种领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。附图说明图1为NtNIP7-1基因的PCR产物电泳图；其中，M-分子量标记；1-PCR产物；图2为中间载体Pdonr-zeo图；图3为NtNIP7-1基因植物RNAi干扰载体pHellsgate12图；图4为转NtNIP7-1基因RNAi干扰载体的烟草株系基因表达水平柱状图；其中，云烟87-野生型对照；NtNIP7-1-1和NtNIP7-1-2为转基因烟株；图5为NtNIP7-1基因RNAi干扰烟草植株的砷离子含量示意图；其中，云烟87-野生型对照；NtNIP7-1-1和NtNIP7-1-2为转基因烟株。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的克隆方法，包括以下步骤：A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；B、NtNIP7-1基因的PCR扩增：以反转录得到的第一链cDNA作为模板，根据NtNIP7-1基因序列设计合成特异性引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。C步骤中所述的特异性引物为：正向引物：5’-ATGGCTAAAGATCAATTGCAAGTGC-3’；反向引物：5’-TTAAACTGGAATTGTTTGTGCATTAT-3’；所述的PCR扩增的反应体系和反应条件如下：。本专利技术所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的应用，其特征在于所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1在获得低砷转基因植株中的应用。所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1应用所得到的烟草品种及其种子和无性繁殖体。本专利技术所述烟草砷转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草砷转运基因NtNIP7‑1，其特征在于所述的烟草砷转运基因NtNIP7‑1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种烟草砷转运基因NtNIP7-1，其特征在于所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1，其特征在于所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.一种权利要求1或2所述的烟草砷转运基因NtNIP7-1的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；B、NtNIP7-1基因的PCR扩增：以反转录得到的第一链cDNA作为模板，根据NtNIP7-1基因序列设计合成特异性引物，进行P...

【专利技术属性】
技术研发人员：白戈，杨大海，逄涛，谢贺，李勇，姚恒，李永平，陈学军，肖炳光，方敦煌，王亚辉，杨春江，张晨东，吴兴富，曾建敏，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53