一种siRNA和抗癌药物疏水性复合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种siRNA和抗癌药物疏水性复合物及其制备方法与应用，该方法通过疏水离子配对（HIP）方法制备HIP[siRNA和抗癌药物]复合物，并包载到PEG‑b‑PLA纳米载体中，起到协同抗癌的作用。该方法包括以下步骤：（1）将水溶性抗癌药物加入到siRNA水溶液中，室温孵育，离心收集形成的HIP[siRNA和抗癌药物]复合物；（2）制备NP[siRNA＆抗癌药物]验证协同抗癌效果。本发明专利技术制备的siRNA和抗癌药物疏水复合物可以很容易地包载到PEG‑b‑PLA纳米载体中，为siRNA和水溶性抗癌药物的共递送提供了新途径，二者联用可以起到协同抗肿瘤的作用，具有巨大的临床应用价值。

A hydrophobic complex of siRNA and anticancer drugs and its preparation method and Application

The present invention discloses a hydrophobic complex of siRNA and anticancer drugs and its preparation method and application. The complex of HIP [siRNA and anticancer drugs] is prepared by hydrophobic ion pairing (HIP) method, and is encapsulated in PEG B PLA nanocarrier to play a synergistic anticancer role. The method includes the following steps: (1) adding water-soluble anticancer drugs into siRNA aqueous solution, incubating at room temperature and centrifuging to form HIP [siRNA and anticancer drugs] complex; (2) preparing NP [siRNA and anticancer drugs] to verify the synergistic anticancer effect. The siRNA and hydrophobic compound of anticancer drugs prepared by the invention can be easily encapsulated in PEG B PLA nanocarriers, providing a new way for the co-delivery of siRNA and water-soluble anticancer drugs. The combination of the two can play a synergistic anti-tumor role and has great clinical application value.

【技术实现步骤摘要】
一种siRNA和抗癌药物疏水性复合物及其制备方法与应用
本专利技术涉及核酸药物和化疗药物共递送领域，具体涉及一种siRNA和抗癌药物疏水性复合物及其制备方法与应用。
技术介绍
选择性下调靶基因表达的RNA干扰技术（RNAi）正成为治疗癌症的最有前途的方法之一，RNAi在体内的成功应用一般通过纳米载体介导的小干扰RNA（siRNA）的传递来实现。一些有力的证据表明，siRNA和传统化疗药物同时递送具有协同抗癌的作用。到目前为止，阳离子脂质和基于聚合物的纳米载体仍是siRNA的主要传递系统。为了实现两种药物的共递送，siRNA通常通过静电作用荷载到带正电荷的纳米载体上，而化疗药物则通过物理包封或化学结合加载到纳米载体上。近几十年来尽管付出了很多努力，这些载有siRNA的阳离子纳米载体的临床转化仍然面临着各种制剂方面的挑战，包括纳米载体设计复杂，难以扩大生产和潜在的毒性等问题。作为一种替代策略，用临床批准的聚（乙二醇）-嵌段-聚（D，L-丙交酯）（PEG-b-PLA）胶束作为递送载体可能是加速临床转化的有效方法。然而，siRNA固有的物理化学特性，包括高分子量，负电性和极端亲水性，使其难以加载到非阳离子纳米载体中。因此，迫切需要探索一种有效且方便的方法通过使用PEG-b-PLA胶束对siRNA和抗癌药物进行共递送。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的一个目的是提供一种siRNA和抗癌药物疏水性复合物及其制备方法。本专利技术的疏水性siRNA和抗癌药物疏水性复合物按照下述方法制备：将不同浓度的抗癌药物（如DOX）·HCl逐渐加入到FAM-siRNA的水溶液中，抗癌药物与siRNA核苷酸（siRNA-nt）单位设置不同摩尔比，在室温下温育后，将混合物溶液离心以收集形成的[siRNA和抗癌药物]复合物的HIP。本专利技术的另一个目的是制备荷载HIP[siRNA＆抗癌药物]纳米颗粒。本专利技术所提供的纳米颗粒，包载了用HIP法制备的[siRNA和抗癌药物]疏水复合物。并从细胞水平和动物水平验证了NP[siRNA和DOX]协同抗肿瘤效果。本专利技术的目的通过以下技术方案实现。一种siRNA和抗癌药物疏水性复合物的制备方法，包括以下步骤：将水溶性抗癌药加入到siRNA水溶液中，室温孵育，离心收集形成了siRNA和抗癌药物疏水性复合物，标记为HIP[siRNA＆抗癌药物]复合物。优选的，步骤（1）所述水溶性抗癌药为盐酸多柔比星、盐酸表柔比星、盐酸柔红霉素、盐酸伊立替康、盐酸托泊替康及修饰后亲水的抗癌药物等。进一步优选为，步骤（1）所述水溶性抗癌药为盐酸多柔比星、盐酸表柔比星、盐酸柔红霉素、盐酸伊立替康和盐酸托泊替康中的一种以上，最优选为DOX。优选的，步骤（1）所述水溶性抗癌药和siRNA的摩尔比值为0.3~2。优选的，步骤（1）所述siRNA水溶液的浓度为6.0nmol/mL，体积为0.5ml,DOX·HCl为0.5mL，配置不同的浓度。优选的，步骤（1）所述室温孵育的时间为10-20min。优选的，步骤（1）所述离心的转速为12000-15000g,离心的时间为5-10min。由以上所述的制备方法制得的一种siRNA和抗癌药物疏水性复合物。以上所述的一种siRNA和抗癌药物疏水性复合物应用于制备荷载HIP[siRNA＆抗癌药物]纳米颗粒，用于共递送干扰核酸和水溶性抗癌药物，包括以下步骤：将含有siRNA和抗癌药物疏水性复合物和mPEG-b-PLA的混合物溶解在二甲基亚砜中，然后在搅拌下加入水中，透析后，离心得到NP[siRNA&抗癌药物]。优选的，所述siRNA和抗癌药物疏水性复合物加入量为0.8mg，mPEG-b-PLA的加入量为10.0mg，DMSO用量为1.0mL，纯水用量为10mL。优选的，所述搅拌的时间为2-4h；所述离心的转速为5000-8000rpm，时间为5-10min。优选的，所述透析所用透析袋MWCO=3500。优选的，所述透析是在4℃下用超纯水透析4小时。本专利技术中siRNA是亲水性药物，抗癌药物也是亲水性的，通过HIP策略制备的[siRNA和抗癌药物]复合物是疏水性的，实现了药物从亲水到疏水的转变，通过疏水作用可以很容易包载到非阳离子载体PEG-b-PLA纳米颗粒中，然后递送到肿瘤细胞内协同发挥抗肿瘤效应。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术通过HIP策略制得的[siRNA和抗癌药物]复合物实现了核酸药物和化疗药物由亲水性向疏水性的转变，可以很容易被包载到临床批准的（PEG-b-PLA）胶束中，且包封率高，可用于核酸药物和化疗药物的共递送，并且该方法可以扩展应用到其他具有疏水结构域的水溶性抗癌药物中，两种药物联用可以协同作用提高临床抗肿瘤效果，具有巨大的临床应用潜能。附图说明图1为包载HIP[siRNA和DOX]的纳米颗粒的粒径分布图。图2为包载HIP[siRNA和DOX]的纳米颗粒的Zeta电位图。图3为包载HIP[siRNA和DOX]的纳米颗粒的透射电子显微图片。图4为DOX在体外从纳米颗粒中的累积释放曲线图。图5为用制备的纳米颗粒处理MDA-MB-231细胞后，细胞中的Plk1mRNA的表达结果图。图6为用制备的纳米颗粒处理MDA-MB-231细胞后，细胞中的Plk1蛋白的的表达结果图。图7为在用不同制剂孵育后诱导MDA-MB-231细胞凋亡情况图。图8为静脉内给药后MDA-MB-231异种移植小鼠肿瘤生长曲线图。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的具体实施做进一步的说明，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1、制备HIP[siRNA和抗癌药物（DOX）]复合物一、HIP[siRNA和DOX]复合物的制备将从大连美仑公司购买的DOX·HCl（0.5mL）逐渐加入到从吉玛公司购买的FAM-siRNA（0.5mL，3.0nmol）的水溶液中，DOX与siRNA核苷酸（siRNA-nt）单位摩尔比为1:1，在室温下温育10分钟后，将混合物溶液以12,000g的速度离心5分钟以收集形成的[siRNA和DOX]复合物的HIP。其他水溶性抗癌药物和siRNA疏水复合物制备方法与此相同。实施例2、NP[siPlk1&DOX]的制备及应用一、NP[siPlk1&DOX]的制备NP[siPlk1&DOX]通过纳米沉淀法制备，将含有siRNA-DOX疏水性复合物（0.8mg）和mPEG-b-PLA（10.0mg）的混合物溶解在1.0mL二甲基亚砜（DMSO）溶液中，然后在搅拌下加入10mL超纯水中，继续搅拌2小时后，将溶液转移到透析袋（MWCO=3500）中，在4℃下用超纯水透析4小时，去掉有机溶剂DMSO,然后将溶液以5000rpm的速度离心5分钟，得到含有NP[siRNA&DOX]的上清液，将其储存在4℃下以备进一步使用。二、NP[siPlk1&DOX]的表征HIP[siRNA&DOX]复合物的包封效率约为41.16±0.47％，得到的NP[siRNA&DOX]粒径约为53±5.7nm（见图1），ζ电位约为-13.2mV（见图2），类似于空白mPEG-b-PLA纳米颗粒的ζ电位。另外，通过透射电子显微镜（TEM）观察到的NP[siRNA&本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种siRNA和抗癌药物疏水性复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将水溶性抗癌药加入到siRNA水溶液中，室温孵育，离心收集形成了siRNA和抗癌药物疏水性复合物，标记为HIP [siRNA＆抗癌药物] 复合物。

【技术特征摘要】
1.一种siRNA和抗癌药物疏水性复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将水溶性抗癌药加入到siRNA水溶液中，室温孵育，离心收集形成了siRNA和抗癌药物疏水性复合物，标记为HIP[siRNA＆抗癌药物]复合物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述水溶性抗癌药为盐酸多柔比星、盐酸表柔比星、盐酸柔红霉素、盐酸伊立替康和盐酸托泊替康中的一种以上。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述水溶性抗癌药和siRNA的摩尔比值为0.3~2。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述siRNA水溶液的浓度为6.0nmol/mL。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述室温孵育的时间为10-20min。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨显珠，张玉喜，王均，李冬冬，许从飞，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44