一种表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白及其制备方法和应用，该制备方法包括：将固体脂肪酸溶解于有机溶剂中，得到脂肪酸溶液；将伴孢晶体蛋白加入至脂肪酸溶液中，在35℃～40℃下搅拌，使伴孢晶体蛋白与脂肪酸发生交联反应，离心沉淀后，烘干，得到表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。本发明专利技术方法通过在伴孢晶体蛋白的外表面均匀包覆一层脂肪酸薄膜，实现伴孢晶体蛋白的表面覆膜工艺，获得的产物，不仅没有影响伴孢晶体蛋白的活性，对二化螟、稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫的毒性没有降低，而且还具有更强的耐雨水冲刷能力和抗紫外线照射能力，为保障晶体蛋白在田间环境条件下的生物有效性和持效性提供了新的技术支持。

A surface-coated parasporal crystal protein of Bacillus thuringiensis and its preparation method and Application

The invention discloses a surface-coated parasporal crystal protein of Bacillus thuringiensis and its preparation method and application. The preparation method includes: dissolving solid fatty acid into organic solvent to obtain fatty acid solution; adding parasporal crystal protein into fatty acid solution and stirring at 35 ~40 ~C to cross-link the parasporal crystal protein with fatty acid, and centrifugal precipitation. Bacillus thuringiensis parasporal crystal protein was obtained by drying. The method realizes the surface coating process of parasporic crystal protein by uniformly coating a layer of fatty acid film on the outer surface of parasporic crystal protein. The obtained product not only does not affect the activity of parasporic crystal protein, but also does not reduce the toxicity to Lepidoptera pests such as Chilo suppressalis, rice leaf roller and so on, and has stronger ability of resisting rainwater scouring and ultraviolet radiation. It provides new technical support for ensuring the bioavailability and sustainability of crystal proteins under field conditions.

【技术实现步骤摘要】
一种表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物农药
，尤其涉及一种表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
农业害虫是限制农作物高产、稳产的重要因素。每年被害虫侵吞的粮食约占总产量的1/4。长期以来，人们寄希望于化学农药，但是单一地使用化学农药，面临着环境污染、残毒上升、人畜中毒等问题，害虫抗药性也直线上升，用药浓度不断提高，防治费用不断增加。在防治害虫的同时，也杀害了天敌，破坏了生态平衡。由此，作为一种防治农林害虫的新技术手段，微生物农药在世界范围内受到广泛重视，其主导产品就是以苏云金杆菌(Bt)为代表的一系列微生物农药制剂。苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)是世界上使用最广、产量最大的生物杀虫剂，但商品Bt制剂在生产上应用也存在速效性差、药效不稳定、田间持效性短等缺点，已成为影响Bt实际用于推广的主要制约因素。苏云金芽孢杆菌是一种在自然界广泛分布的革兰氏阳性细菌,其突出特征是在芽孢形成过程中，可产生伴孢晶体蛋白。伴孢晶体蛋白由一种或多种蛋白组成,具有高度特异杀虫活性，这种蛋白通常被称为杀虫晶体蛋白。伴孢晶体蛋白以原毒素的状态存在，当它进入敏感昆虫的消化道后，在碱性环境中溶解并被蛋白酶激活成毒性多肽，活化的毒性多肽与昆虫中肠道的纹缘膜上的受体相结合，并且在细胞膜上形成孔道，破坏细胞的渗透平衡，引起细胞裂解，最终导致幼虫的死亡。目前，市售的Bt杀虫剂，主要是将Bt发酵液中的发酵产物进行富集，然后制成制剂，混杂了Bt孢子、伴孢晶体和营养体等各种成分，其中伴孢晶体含量低、稳定性差，田间使用时，易因紫外线辐射、雨水冲刷等问题，导致Bt制剂药效不稳定、持效期短，影响了这类生物农药的推广和使用。因此，上述技术问题的解决，将为农业生产提供杀虫效果更稳定、活性更高的Bt制剂，促进此类生物农药的推广使用，从而更好的保护生态环境。
技术实现思路
本专利技术针对Bt晶体蛋白无法直接用于制备杀虫剂的问题，提供了一种表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白及其制备方法和应用，该制备方法制得伴孢晶体蛋白的外表面均匀的包覆了一层脂肪酸薄膜，不仅没有影响伴孢晶体蛋白活性，对二化螟、稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫的毒性没有降低，而且还具有更强的耐雨水冲刷能力和抗紫外线照射能力，为保障晶体蛋白在田间环境条件下的生物有效性和持效性提供了新的技术支持。具体技术方案如下：一种表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)将固体脂肪酸溶解于有机溶剂中，得到脂肪酸溶液；(2)将苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白加入至脂肪酸溶液中，在35℃～40℃下以1000～1500转/分钟的转速进行剪切，使伴孢晶体蛋白与脂肪酸发生交联反应，离心，收集沉淀，烘干，得到表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。本专利技术中，苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体通过上述覆膜，抗紫外线辐射的能力和耐雨水冲刷的性能得到了提高。进一步地，步骤(1)中，所述的固体脂肪酸为硬脂酸、软脂酸和月桂酸中的一种或两种以上的混合物。硬脂酸，即十八烷酸，结构简式为CH3(CH2)16COOH；软脂酸，为十六烷酸，又名棕榈酸，结构简式为CH3(CH2)14COOH。二者均为饱和高级脂肪酸，不溶于水，易溶于有机溶剂，是一类阴离子表面活性剂，其分子的一端为长链烃基，与有机物和聚合物有一定的相容性，另一端为极性羧基，与蛋白晶体表面的羟基能够发生化学键合。进一步地，步骤(1)中，所述的有机溶剂为正丁醇、异丙醇、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、四氯化碳和乙酸乙酯中的一种或两种以上的混合物。作为优选，硬脂酸宜用正丁醇进行溶解，软脂酸宜用乙醇进行溶解，月桂酸宜用甲醇进行溶解。伴孢晶体蛋白与脂肪酸的质量比会影响晶体表面覆膜的完整性。进一步地，步骤(2)中，所述伴孢晶体蛋白与脂肪酸的质量比为1：0.1～10。作为优选，所述伴孢晶体蛋白与脂肪酸的质量比为1：1～6。剪切的转速和时间会影响晶体的完整性和覆膜的连续性，剪切速度过慢，晶体无法在脂肪酸的溶液中均匀分散，从而导致晶体聚集部位无法覆膜，剪切速度过快，则有可能打碎晶体，影响晶体蛋白活性；加热温度过高则易使晶体蛋白丧失活性，温度过低则不易发生化学键合反应，从而导致晶体蛋白无法覆膜。进一步地，步骤(2)中，所述剪切的时间为20～40min。进一步地，所述离心的速度为3000～5000转/分钟，时间为5～6分钟。本专利技术提供了一种如上述制备方法制得的表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。本专利技术还提供了所述的表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白在制备生物杀虫剂中的应用，其中，所述生物杀虫剂的制剂不受限制，主要包括悬浮剂、可分散粒剂、干悬浮剂、种衣剂、油悬浮剂和水乳剂等；可用于有效防治如水稻、小麦、玉米、大豆、蔬菜、果树、棉花和园林花卉树木等农作物和林业上的鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目和同翅目等害虫。本专利技术还提供了一种生物杀虫剂，为油悬浮剂，以质量百分数计，包括以下组分：其余为油酸甲酯；其中，所述表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的数量为5×1010～8×1011个，由表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的制备方法制得。本专利技术还提供了该生物杀虫剂的制备方法，包括：(A)采用表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的制备方法制得的表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白；(B)将所述表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白与乳化分散剂、嵌段聚醚、有机膨润土和油酸甲酯混合后，剪切、磨碎后，得到生物杀虫剂。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术方法通过在苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的外表面均匀包覆一层脂肪酸薄膜，实现伴孢晶体蛋白的表面覆膜工艺，获得的产物，不仅没有影响伴孢晶体蛋白的活性，对二化螟、稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫的毒性没有降低，而且还具有更强的耐雨水冲刷能力和抗紫外线照射能力，为保障晶体蛋白在田间环境条件下的生物有效性和持效性提供了新的技术支持。(2)本专利技术制备表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的方法简单，覆膜后的晶体蛋白抗逆性强，在植物叶片上的附着性更好，防治害虫效果佳；对环境污染少，对人和牲畜安全。附图说明图1为实施例1中表面覆膜前后的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的扫描电镜图；其中，A为表面覆膜前的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白；B为表面覆膜后的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。具体实施方式下述实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。在不脱离以下公开的本专利技术精神和范围的情况下可以做出许多其它可能的修改方案和变化方案。另外，说明书仅用于举例说明的目的，所使用的术语在性质上为描述性的而非限制性的，因此，本专利技术可以以具体描述之外的方式实施。本专利技术所采用的脂肪酸(包括硬脂酸(C18H36O2)、软脂酸(C16H32O2)、月桂酸(C12H34O2)和有机溶剂均为市售产品。实施例1表面覆膜的苏芸金杆菌伴孢晶体蛋白的制备1、苏芸金杆菌伴孢晶体蛋白的分离取1g苏芸金杆菌发酵后的固体不溶物，150mL、质量分数为40％的PEG-4000，150mL、质量分数为40％的K2HPO4-KH2PO4(3:1)和200mL的水；将上述各成分均置于分液漏斗中，震荡混合，静置至分层；其中，上层为芽孢，中间层为伴孢晶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将固体脂肪酸溶解于有机溶剂中，得到脂肪酸溶液；(2)将苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白加入至脂肪酸溶液中，在35℃～40℃下以1000～1500转/分钟的转速进行剪切，使伴孢晶体蛋白与脂肪酸发生交联反应，离心，收集沉淀，烘干，得到表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将固体脂肪酸溶解于有机溶剂中，得到脂肪酸溶液；(2)将苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白加入至脂肪酸溶液中，在35℃～40℃下以1000～1500转/分钟的转速进行剪切，使伴孢晶体蛋白与脂肪酸发生交联反应，离心，收集沉淀，烘干，得到表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。2.如权利要求1所述的表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的固体脂肪酸为硬脂酸、软脂酸和月桂酸中的一种或两种以上的混合物。3.如权利要求1所述的表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的有机溶剂为正丁醇、异丙醇、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、四氯化碳和乙酸乙酯中的一种或两种以上的混合物。4.如权利要求1所述的表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述伴孢晶体蛋白与脂肪酸的质量比为1：0.1～10。5.如权利要求1所述的表面覆膜的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔丽雅，陈梦丽，林婷，胡斌，朱瞬瞬，谢烽，朱国念，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33