显微镜的光学路径中盖玻片的倾斜度测量和校正制造技术

本发明专利技术涉及一种在显微镜(1)的光学路径中调整样品保持件(7)的方法，其中将照明辐射(BS)中的至少一个束指引到样品保持件(7)上；通过检测器(19)检测由样品保持件(7)反射的一部分照明辐射(BSref)并且确定检测的照明辐射(BSref)的测量值；根据测量值，确定关于光学路径的样品保持件(7)的实际的目前位置；将确定的实际位置与期望的位置比较，并且产生用于修改实际的位置的控制命令，通过执行该控制命令将样品保持件(7)移动到期望的位置中。

Measuring and Correcting the Tilt of Cover Glass in Optical Path of Microscope

The invention relates to a method for adjusting sample holder (7) in the optical path of a microscope (1), in which at least one beam of illumination radiation (BS) is directed to the sample holder (7); a portion of illumination radiation (BSref) reflected by the sample holder (7) is detected by a detector (19) and the measured value of the detected illumination radiation (BSref) is determined; and the optical path is determined according to the measured value. The actual current position of the sample holder (7); compares the determined actual position with the desired position, and generates a control command for modifying the actual position, and moves the sample holder (7) to the desired position by executing the control command.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】显微镜的光学路径中盖玻片的倾斜度测量和校正
本专利技术涉及在显微镜的束路径中调整样品保持件的方法。
技术介绍
光片显微术的主要应用中的一个存在于以几百μm上至若干毫米的尺寸来成像例如有机体的中型样品。通常，这些样品包埋在琼脂糖中并且布置在玻璃毛细管中。出于检查样品的目的，将玻璃毛细管引入到充满水的样品室中并且将具有样品的琼脂糖按压出毛细管一点。由光片照明样品。通过检测物镜，将样品中激发的并且从样品发出的荧光成像到特别是照相机的检测器上，该检测物镜垂直于光片并且因此还垂直于光片光学单元。根据现有技术，光片显微术的显微镜1的布局(SPIM布局、单平面照明显微术)包括照明物镜2和检测物镜3(下面也称为SPIM物镜)，将照明物镜2和检测物镜3各自从上方相对于样品平面4以45°的角且关于彼此以直角指引到样品平面4上(参见图1a)。布置在样品平面4上的样品5位于例如实施为培养皿的样品保持件7的基底上。用例如水的液体8填充样品保持件7，并且在应用光片显微术期间将两个SPIM物镜2、3浸没在液体8中(未示出)。样品平面4延伸在由笛卡尔坐标系中的X轴X和Y轴Y所跨越的XY平面中。第一光轴A1和第二光轴A2延伸在由笛卡尔坐标系中的Y轴Y和Z轴Z所跨越的平面YZ中。该方法提供了轴线方向上的高分辨的优点，因为薄光片6可以通过照明物镜2来产生。由于更高的分辨率，可以检查更小的样品5。此外，显著地降低麻烦的背景荧光并且由此改进信噪比。根据现有技术，借助于通过位于样品5下方的宽场物镜20垂直穿过样品保持件7的透明基底所记录的宽场像，来产生与样品平面4和样品保持件7平行的概览像。发射的光对样品5的照明并且捕获该发射的光在此是不可能的，因为两个SPIM物镜2、3相对于彼此布置得太紧。为了在诸如多孔板的标准样品容器中促进更简易的样品准备，可以维持45°配置但是具有倒置布置中的两个SPIM物镜2、3，将两个SPIM物镜2、3从下方穿过样品保持件7的透明基底指引到样品平面4中(图1b)。在这个布置中，必须通过使用特别的光学元件来校正由样品保持件7引起的像差，该样品保持件7相对于光轴A1和A2倾斜并且以盖玻片的形式出现。穿过样品保持件7的基底照明布置在样品平面4中的样品5，并且检测样品5的激发的荧光。可以使用诸如多孔板、培养皿和/或物体支撑件的样品保持件7，并且特别地在高通量筛选的情况下可以避免样品5的污染。如果例如Alvarez板12布置在照明物镜2和/或检测物镜3的束路径中(图1b)，则其它技术难题发生(US3305294A)。Alvarez板12以它们校正像差的方式来实施，该像差可能恰好发生在例如盖玻片的样品保持件7和相应的物镜2、3的光轴A1、A2之间设定的角的情况下。导致较差图像质量的不需要的像差已经发生在小角度偏离(例如＜0.1°)的情况下。因此，例如在实验开始之前必须将盖玻片对准使得角度偏离位于可容许的公差内。此外，有帮助的是，如果除了角度以外，在物镜2、3之间的距离或者可能出现的附加的透镜(例如弯月形透镜)以及盖玻片也是可调整的，使得样品5或其将要成像的区域位于检测物镜3的像平面BE中。DE102007046601A1公开了在反射的光系统中调整灯具的设备。至少一个孔径光阑布置在所述反射的光系统中的反射的光照明束路径中。检测器布置在反射的光系统的检测束路径中。反射的光照明束路径和检测束路径一起延伸并且在部分反射的光系统中平行。在部分反射的光系统中，光学元件是可定位的，随着光学元件将孔径光阑成像到检测器上。DE102008007178A涉及激光扫描显微镜的校准设备，其具有在公共框架中牢固地彼此对准的聚焦光学单元和布置在聚焦光学单元的焦平面中的测试结构，所述测试结构具有在反射光和/或透射光中可检测的结构元件。显微镜中，测试结构可切换到显微镜束路径中，使得聚焦光学单元的光瞳与激光扫描显微镜的物镜光瞳重合或者所述光瞳位于与其共轭的平面中。从由McGorty等人的出版物(2015：用于常规安装的样品的顶部开口的选择性平面照明显微镜(Open-topselectiveplaneilluminationmicroscopeforconventionallymountedspecimens)，光学快报23：16142-16153)获悉校正由盖玻片引起的显微镜的像差的可能性。倒置的SPIM显微镜包含具有以下效果的水棱镜：部分地补偿由于穿过盖玻片的检测光的倾斜通道发生的像差。
技术实现思路
本专利技术基于以下目的：提出在显微镜的束路径中调整样品保持件的方法。该目的由根据独立权利要求1的主题实现。在从属权利要求中指定有利的配置。该目的由在显微镜的束路径中调整样品保持件的方法来实现，其中将照明辐射中的至少一个束指引到样品保持件上。通过检测器捕获由样品保持件反射的照明辐射的分量，并且确定捕获的照明辐射的测量值。样品保持件的相对于束路径的目前实际的定位方式(下文也称为实际位置)取决于这些测量值来确立。比较确立的实际的定位方式与预期的定位方式(下文也称为预期的位置)，并且产生修改实际的定位方式的控制命令，执行该控制命令引起样品保持件移动到预期的定位方式中。本专利技术的核心在于，使用照明辐射的反射分量(反射)以关于样品保持件的相对角度位置和其关于束路径的距离对例如盖玻片的样品保持件进行调整。例如，在盖玻片的上侧和下侧通常反射照明辐射的分量。在各种情况下，这些界面处的反射通常以近似3％的反射率发生。在此，照明辐射的反射分量通常实质上完整的位于检测器NA内。其结果是，可以将反射分量很大程度上成像在光学连接到检测物镜的检测器上。这个反射分量现在可以用于关于角度和距离对盖玻片的进行调整。不需要在绝对项中建立实际的定位方式，例如以独立坐标系的坐标的形式。在方法的配置中，实际位置还可以是确立为关于束路径的相对位置关系的形式。当样品保持件设想为预料的或期望的定位方式时达到预期的定位方式。可以确定预期的定位方式的可容许的公差。提供照明辐射并且将该照明辐射指引到品保持件上作为单独射线(束)中的至少一个束。在此，在根据本专利技术的方法的各种配置中，照明辐射可以是具有自重构束或非衍射束的辐射，并且可以实施为例如高斯束、贝塞尔束、Mathieu束、sinc3束、晶格光片、相干贝塞尔束、分段贝塞尔束或艾里束的形式并且可以被指引到样品保持件上。根据具有椭圆坐标的赫姆霍兹方程，Mathieu束可以被认为是传播不变的光场(Gutierrez-Vega，J.C.etal，2001：光学Mathieu束的实验演示(ExperimentaldemonstrationofopticalMathieubeams)；光学通信195：35-40)。在方法的其它配置中，将形式为光片的照明辐射指引到样品保持件。在此，在方法的一个配置中，可以用与用于成像的照明辐射的波长不同的波长的照明辐射来产生光片。这有利地降低了图像质量的损害，并且可以通过用于产生光片的波长及其强度的目标选择来减少照明辐射在样品上的光漂白(bleaching)效应。因此，可以使用不同的照明辐射，例如以便于执行根据本专利技术的方法的不同的分步骤。在方法的有利配置中使用实施为倒置的显微镜的显微镜。倒置显微镜包括具有第一光轴的照明物镜，其中第一光轴穿透由X轴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种方法，用于在显微镜(1)的束路径中调整样品保持件(7)，其中将照明辐射(BS)中的至少一个束指引到所述样品保持件(7)上，通过检测器(19)捕获由所述样品保持件(7)反射的所述照明辐射的分量(BSref)并且确定捕获的照明辐射(BSref)的测量值；取决于所述测量值确立所述样品保持件(7)关于所述束路径的目前的实际的定位方式，将确立的实际的定位方式与预期的定位方式比较，并且产生用于修改所述实际的定位方式的控制命令，所述控制命令的执行引起所述样品保持件(7)移动到所述预期的定位方式中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.01 DE 102016212019.01.一种方法，用于在显微镜(1)的束路径中调整样品保持件(7)，其中将照明辐射(BS)中的至少一个束指引到所述样品保持件(7)上，通过检测器(19)捕获由所述样品保持件(7)反射的所述照明辐射的分量(BSref)并且确定捕获的照明辐射(BSref)的测量值；取决于所述测量值确立所述样品保持件(7)关于所述束路径的目前的实际的定位方式，将确立的实际的定位方式与预期的定位方式比较，并且产生用于修改所述实际的定位方式的控制命令，所述控制命令的执行引起所述样品保持件(7)移动到所述预期的定位方式中。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述照明辐射(BS)以光片(6)的形式指引到所述样品保持件(7)上。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述照明辐射(BS)是具有自重构射线的辐射。4.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，所述照明辐射(BS)以高斯束、贝塞尔束、相干贝塞尔束、分段贝塞尔束、sinc3束、晶格光片、艾里束或Mathieu束的形式被指引到所述样品保持件(7)上。5.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，以与用于成像的照明辐射(BS)的波长不同的波长的照明辐射(BS)来产生所述光片(6)。6.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，使用实施为倒置的显微镜(1)的显微镜(1)，该显微镜包括：具有第一光轴(A1)的照明物镜(2)和具有第二光轴(A2)的检测物镜(3)，其中所述第一光轴(A1)与由X轴(X)和正交于所述X轴(X)的Y轴(Y)所跨越的样品平面(4)相交，并且所述检测物镜(3)实施为检测来自所述样品平面(4)的光，其中所述照明物镜(2)和所述检测物镜(3)关于彼此并且关于所述样品平面(4)对准，使得所述第一光轴(A1)和所述第二光轴(A2)在所述样品平面(4)中相交并且包含其间的实质的直角，并且所述第一光轴(A1)和所述第二光轴(A2)各包含与第三轴线(A3)成不同于零的角，所述第三轴线(A3)在Z轴(Z)的方向上正交地指向所述样品平面(4)并且用作参考轴线(B)。7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，使用实施为倒置显微镜(1)的显微镜(1)，所述显微镜(1)包括：具有第一光轴(A1)的照明物镜(2)和具有第二光轴(A2)的检测物镜(3)，其中所述照明物镜(2)实施为通过所述照明辐射(BS)产生光片(6)，其中至少部分地在由X轴(X)和正交于所述X轴(X)的Y轴(Y)所跨越的样品平面(4)中产生或可产生所述光片(6)，并且所述检测物镜(3)实施为检测来自所述样品平面(4)的光，其中所述照明物镜(2)和所述检测物镜(3)关于彼此并且关于所述样品平面(4)对准，使得所述第一光轴(A1)和所述第二光轴(A2)在所述样品平面(4)中相交并且包含其间的实质的直角，并且所述第一光轴(A1)和所述第二光轴(A2)各包含与第三轴线(A3)成不同于零的角，所述第三轴线(A3)在Z轴(Z)的方向上正交地指向所述样品平面(4)并且用作参考轴线(B)。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，在步骤1中，所述样品保持件(7)具有对所述照明辐射(BS)透明、包含第一侧面(OS)和第二侧面(US)的基底，将所述样品保持件(7)在所述Z轴(Z)的方向上移位，直到由所述基底的第一侧面(OS)反射的照明辐射的分量(BSref)被捕获，并且修改所述样品保持件(7)和所述检测器(19)关于彼此的相对位置使得捕获的分量(BSref)的实际的相对位置接近所述检测器(19)上的预期的相对位置。步骤2中，借助于确立实际的相对位置与预期的相对位...

【专利技术属性】
技术研发人员：J西本摩根，T卡尔克布伦纳，
申请(专利权)人：卡尔蔡司显微镜有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE