本发明专利技术公开了一种AKR在MIN6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用，在不同浓度葡萄糖环境下，设置不同浓度水平的GC干预，通过刺激PKA信号通路，并且在添加刺激剂ISO前后，利用FRET技术实时定量测定PKA的含量，探讨GC怎样通过第二信使PKA信号通路在胰岛β细胞胰岛素分泌中发挥作用，从而进一步补充我们前期关于2型糖尿病的发病机制研究中的欠缺，并为新的糖尿病靶向治疗药物的研发提供实验室方面的依据。
【技术实现步骤摘要】
AKR在MIN6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用
本专利技术属于医学
，具体地说，涉及AKR在MIN6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用。
技术介绍
前期的相关研究表明，在不同葡萄糖浓度的情况下，不同浓度的GC通过cAMP、DAG、PKC等信号通路途径，上调其在细胞内的含量，对胰岛β细胞分泌胰岛素有促进作用，但是cAMP信号通路的下游信号分子PKA是否影响GC在胰岛β细胞胰岛素的分泌方面的作用，如果影响又是怎样影响GC发挥作用的问题还有待进一步明确。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种AKR在MIN6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用，在不同浓度葡萄糖环境下，设置不同浓度水平的GC干预，通过刺激PKA信号通路，并且在添加刺激剂ISO前后，利用FRET技术实时定量测定PKA的含量，探讨GC怎样通过第二信使PKA信号通路在胰岛β细胞胰岛素分泌中发挥作用，从而进一步补充关于2型糖尿病的发病机制研究中的欠缺，并为新的糖尿病靶向治疗药物的研发提供实验室方面的依据。其具体技术方案为：一种AKR在MIN6细胞中胰岛素分泌机制研究的方法，包括以下步骤：步骤1、细胞培养用含15％胎牛血清(FBS)、4.5g/L葡萄糖、2％青链霉素、1％L-谷氨酰胺及1％β-巯基乙醇的DMEM培养基，在37℃含5％CO2的培养箱中培养，传代至4～15代用于实验。步骤2、分组将MIN6细胞以4×105/孔于6孔培养板中培养，在对数生长期用于实验。一组用于ELISA检测MIN6胞内未添加ISO胰岛素释放量，一组用于ELISA检测MIN6胞内添加ISO胰岛素释放量，细胞分为3部分后分别在无糖、低糖、高糖环境下培养，之后给予不同浓度的Glg(0、500、1000ng/L)干预处理；一组用于FRET技术检测PKA水平。步骤3、方法3.1基于FRET技术在不同浓度葡萄糖和GC干预下实时定量检测PKA；3.2ELISA法检测各组MIN6细胞胰岛素的释放量；3.2.1采集MIN6细胞胰岛素样品；(1)MIN6细胞传代于5个6孔培养板，待其贴壁稳定，状态良好；(2)小心吸出培养基，换入含2％FBS(其它成分及比例相同)的培养基，继续在37℃环境下培养；(3)培养约12h后吸出原有培养基，用Krebs液轻轻冲洗1次，在每孔培养皿加入1mlKrebs液，在37℃环境下孵育2h；(4)吸出原有Krebs液，向各孔培养皿中分别加入处理液1ml，空白对照组直接加入1mlKerbs，37℃培养箱孵育1h；(5)分别吸取每孔的细胞上清液，移入1.5ml离心管，做好标记后剪取封口膜密封，保存于-20℃冰箱待测；3.2.2测定MIN6细胞上清中胰岛素(1)准备试剂盒：(2)检测程序：(3)结果计算与判断：①以4000pg/ml、2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、0pg/ml等浓度的标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标，画出标准曲线图；②根据测得的细胞上清液样品OD值，在标准曲线上计算出相应胰岛素含量，乘上稀释倍数后得出样品内胰岛素含量。步骤4、统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，采用双侧检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。优选地，步骤3.1具体为：(1)在荧光显微镜下观察转染48h后的MIN6细胞，其荧光蛋白表达良好，转染效率约80％-90％；(2)小心吸出原有培养基，Krebs液冲洗2遍；(3)每个培养皿中加入0.5mlKrebs液，放回培养箱；(4)任取一个培养皿，放在激光共聚焦显微镜下，定位单个细胞后换用油镜观察；(5)在激光共聚焦计算机软件上设置好激发波长和发射波长范围，开始采集图像；(6)各培养皿根据实验分组依次加入药物；(7)以时间为横坐标、CFP/YFP比值为纵坐标画图。进一步，所述准备试剂盒具体为：①打开10×标本稀释液母液包装，按照10×标本稀释液:双蒸水＝1:10的比例，加入双蒸水稀释标本稀释液；②标准品液的配制：打开标准品液包装，用微量移液枪加入500μl双蒸水混匀，将其配制成40ng/ml的溶液。准备8个干净的离心管，分别标记1-8，向管1中加入900μl标本稀释液，管2至管8中各加入500μl标本稀释液。向管1中加入100μl40ng/ml的标准品溶液混匀，用微量移液枪从其中吸出500μl移至管2，如此反复操作，将各管溶液进行稀释，最后从管7中吸出500μl弃去，管8作为空白对照；③按照洗涤液母液液:双蒸水＝1:10的比例，稀释洗涤液；④按照标本:双蒸水＝1:20的比例，稀释收集到的细胞上清液标本。进一步，所述检测程序具体为：①分别吸取100μl的标准品，加入每个反应孔中，充分混匀，在37℃环境下静置40min；②用稀释好的洗涤液充分洗涤反应板约5次，用滤纸将反应板上的水分吸干；③除空白组以外，向每个反应孔各加50μl双蒸水和第一抗体工作液，充分混匀，在37℃环境下静置20min；④用稀释好的洗涤液充分洗涤反应板约5次，用滤纸将反应板上的水分吸干；⑤分别吸取100μl的酶标抗体工作液，加入到每个反应孔中，充分混匀，在37℃环境下静置10min；⑥用稀释好的洗涤液充分洗涤反应板约5次，用滤纸将反应板上的水分吸干；⑦分别吸取100μl的底物工作液，加入到每个反应孔中，充分混匀，放在37℃环境下避光反应15min；⑧分别吸取100μl的终止液，加入每个反应孔中，充分混匀；⑨用Bio-RAD酶标仪在450nm处测OD值，此操作必须在30min内完成。⑩同样的方法检测待测样品。本专利技术所述AKR在MIN6细胞中胰岛素分泌机制研究的方法在糖尿病靶向治疗药物制备过程中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术在不同浓度葡萄糖环境下，设置不同浓度水平的GC干预，通过刺激PKA信号通路，并且在添加刺激剂ISO前后，利用FRET技术实时定量测定PKA的含量，探讨GC怎样通过第二信使PKA信号通路在胰岛β细胞胰岛素分泌中发挥作用，从而进一步补充关于2型糖尿病的发病机制研究中的欠缺，并为新的糖尿病靶向治疗药物的研发提供实验室方面的依据。附图说明图1无葡萄糖低GC组MIN6细胞内PKA的检测，将转染AKR48h后的MIN6细胞换液，加入0.5mlKrebs液，放在激光共聚焦显微镜下，定位单个细胞视野后换用油镜观察，设置激发波长和发射波长范围，扫描时间设置为25s/次，开始图像采集，扫描至75s，此为空白处理阶段，加0.5mlkrebs液于培养皿中，保持葡萄糖浓度为0mmol/L，扫描至385s，此为0ng/LGC阶段，等同于空白处理阶段，加入0.5ml终浓度为500ng/L的GC液，扫描至745s，此为500ng/LGC阶段，加入刺激剂ISO，约至1010s停止扫描，其中，A、B、C分别为CFP、YFP、FRET现象的荧光图像，D为CFP、YFP、FRET的重叠图像，E为动态FRET现象的扫描截图；图2无葡萄糖低GC组MIN6细胞CFP/YFP的变化情况，与空白处理阶段相比，#P﹤0.05；与500ng/LGC阶段相比，*P﹤0.05。图3无葡萄糖高GC组MIN6细胞内PKA的检测，将转染本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种AKR在MIN6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、细胞培养用含15％胎牛血清、4.5g/L葡萄糖、2％青链霉素、1％L‑谷氨酰胺及1％β‑巯基乙醇的DMEM培养基，在37℃含5％CO2的培养箱中培养，传代至4～15代用于实验；步骤2、分组将MIN6细胞以4×105/孔于6孔培养板中培养，在对数生长期用于实验；一组用于ELISA检测MIN6胞内未添加ISO胰岛素释放量，一组用于ELISA检测MIN6胞内添加ISO胰岛素释放量，细胞分为3部分后分别在无糖、低糖、高糖环境下培养，之后给予不同浓度的Glg：0、500、1000ng/L，干预处理；一组用于FRET技术检测PKA水平；步骤3、方法3.1基于FRET技术在不同浓度葡萄糖和GC干预下实时定量检测PKA；3.2ELISA法检测各组MIN6细胞胰岛素的释放量；3.2.1采集MIN6细胞胰岛素样品；(1)MIN6细胞传代于5个6孔培养板，待其贴壁稳定，状态良好；(2)小心吸出培养基，换入含2％FBS的培养基，继续在37℃环境下培养；(3)培养12h后吸出原有培养基，用Krebs液轻轻冲洗1次，在每孔培养皿加入1ml Krebs液，在37℃环境下孵育2h；(4)吸出原有Krebs液，向各孔培养皿中分别加入处理液1ml，空白对照组直接加入1ml Kerbs，37℃培养箱孵育1h；(5)分别吸取每孔的细胞上清液，移入1.5ml离心管，做好标记后剪取封口膜密封，保存于‑20℃冰箱待测；3.2.2测定MIN6细胞上清中胰岛素(1)准备试剂盒：(2)检测程序：(3)结果计算与判断：①以4000pg/ml、2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、0pg/ml浓度的标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标，画出标准曲线图；②根据测得的细胞上清液样品OD值，在标准曲线上计算出相应胰岛素含量，乘上稀释倍数后得出样品内胰岛素含量；步骤4、统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，采用双侧检验，P...
【技术特征摘要】
1.一种AKR在MIN6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、细胞培养用含15％胎牛血清、4.5g/L葡萄糖、2％青链霉素、1％L-谷氨酰胺及1％β-巯基乙醇的DMEM培养基，在37℃含5％CO2的培养箱中培养，传代至4～15代用于实验；步骤2、分组将MIN6细胞以4×105/孔于6孔培养板中培养，在对数生长期用于实验；一组用于ELISA检测MIN6胞内未添加ISO胰岛素释放量，一组用于ELISA检测MIN6胞内添加ISO胰岛素释放量，细胞分为3部分后分别在无糖、低糖、高糖环境下培养，之后给予不同浓度的Glg：0、500、1000ng/L，干预处理；一组用于FRET技术检测PKA水平；步骤3、方法3.1基于FRET技术在不同浓度葡萄糖和GC干预下实时定量检测PKA；3.2ELISA法检测各组MIN6细胞胰岛素的释放量；3.2.1采集MIN6细胞胰岛素样品；(1)MIN6细胞传代于5个6孔培养板，待其贴壁稳定，状态良好；(2)小心吸出培养基，换入含2％FBS的培养基，继续在37℃环境下培养；(3)培养12h后吸出原有培养基，用Krebs液轻轻冲洗1次，在每孔培养皿加入1mlKrebs液，在37℃环境下孵育2h；(4)吸出原有Krebs液，向各孔培养皿中分别加入处理液1ml，空白对照组直接加入1mlKerbs，37℃培养箱孵育1h；(5)分别吸取每孔的细胞上清液，移入1.5ml离心管，做好标记后剪取封口膜密封，保存于-20℃冰箱待测；3.2.2测定MIN6细胞上清中胰岛素(1)准备试剂盒：(2)检测程序：(3)结果计算与判断：①以4000pg/ml、2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、0pg/ml浓度的标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标，画出标准曲线图；②根据测得的细胞上清液样品OD值，在标准曲线上计算出相应胰岛素含量，乘上稀释倍数后得出样品内胰岛素含量；步骤4、统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，采用双侧检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。2.根据权利要求1所述的AKR在MIN6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用，其特征在于，步骤3.1具体为：(1)在荧光显微镜下观察转染48h后的MIN6细胞，其荧光蛋白表达良好，转...
【专利技术属性】
技术研发人员：李军，李思源，张君，李含晖，尹亮，火睿，李佳佳，胡颖，王双，石艳秋，胡倩，
申请(专利权)人：李军，
类型：发明
国别省市：新疆,65
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