一种检测外泌体中miRNA-1246的纳米金核酸探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种检测外泌体中miRNA‑1246的纳米金核酸探针及其制备方法和应用，其由纳米金、5'‑CCT GCT CCA AAA ATC CAT TAAAAAAA SH‑3'和带有荧光基团的5'‑AAT GGA TTT TTG‑3'制成。本发明专利技术探针能直接进入外泌体中进行miR‑1246表达水平的检测，获得了100％的准确率和92.3％的特异性；说明利用本发明专利技术建立的基于纳米金核酸探针的检验方法具有临床诊断乳腺癌的应用前景，其优点是准确，结果重现性好，简单，快速，经济，无创。可用于乳腺癌转移的早期诊断、转移风险评估、治疗疗效评估和调整治疗方案、基因测试筛选精准治疗候选病人等。

【技术实现步骤摘要】
一种检测外泌体中miRNA-1246的纳米金核酸探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种检测外泌体中miRNA-1246的纳米金核酸探针及其制备方法和应用。
技术介绍
乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，严重威胁女性健康和生命，且近10年乳腺癌发病率和死亡率都呈上升趋势。早期发现、早期诊断，是提高疗效的关键。外泌体是细胞分泌的直径为30-100nm的囊泡，多项研究发现[参考文献:Zhu,J.；Zheng,Z.；Wang,J.；Sun,J.；Wang,P.；Cheng,X.Y.；Fu,L.；Zhang,L.M.；Wang,Z.J.；Li,Z.Y.DifferentMiRNAExpressionProfilesBetweenHumanBreastCancerTumorsandSerum.Front.Genet.2014,5,149-156.Pigati,L.；Yaddanapudi,S.C.S.；Iyengar,R.；Kim,D.J.；Hearn,S.A.；Danforth,D.；Hastings,M.L.；Duelli,M.D.SelectiveReleaseofMicroRNASpeciesfromNormalandMalignantMammaryEpithelialCells.PlosOne.2010,5,e13515.Hannafon,B.N.；Trigoso,Y.D.；Calloway,C.L.；Zhao,Y.D.；Lum,D.H.；Welm,A.L.；Zhao,Z.Z.；Blick,K.E.；Dooley,W.C.；Ding,W.Q.PlasmaExosomeMicroRNAsareIndicativeofBreastCancer.BreastCancerRes.2016,18,90-104Li,X.J.；Ren,Z.J.；Tang,J.H.；Yu,Q.ExosomalMicroRNAMiR-1246PromotesCellProliferation,InvasionandDrugResistancebyTargetingCCNG2inBreastCancer.CellPhysiol.Biochem.2017,44,1741-1748.]，乳腺癌细胞MCF-7分泌的外泌体有选择性富集其亲本细胞中miR-1246，且量远远高于正常乳腺细胞外泌体相应的miRNA含量。由于外泌体可以相对较好地保护其内的miRNA免受体液中核酸酶的降解，比传统的肿瘤标志物更加稳定可靠，同时外泌体在外周血中具有很高的丰度，且血样较传统的侵入式取样方便易得，因此，通过直接检测外周血外泌体中与乳腺癌相关的特征miRNA如miR-1246的异常表达，将有望成为一种简便无创、灵敏准确的癌症早期筛选的辅助手段。现有的外泌体中核酸的定量检测方法主要有：原位杂交技术、实时定量PCR、电化学传感方法等等。这些方法各有局限，如原位杂交技术虽然特异性好但灵敏度较低，需要较多的样本；实时定量PCR法操作繁琐，需要一系列程序，即外泌体裂解，miRNA分离，cDNA合成和miRNA分析，准确度和精密度较差。所以开发能直接进入外泌体内部进行核酸检测的探针用于疾病诊断，将具有简单、经济、准确等优点，具有很好的临床应用前景。但是，由于外泌体的粒径只有30-100nm，限制了很多探针直接进入其中，因此最有可能直接进入外泌体的探针候选者是一些纳米级别探针。纳米金核酸探针由于其表面连接的寡核苷酸链密度高，使探针不易凝聚、稳定性好、灵敏高，并且多篇文献报到纳米金核酸探针可以不用特殊处理即可进入到细胞系。但是迄今我们未发现有不借助转染工具而直接进入外泌体中进行核酸检测的探针报道。而仅有一篇文献(AlhasanAH,PatelPC,ChoiCHJ,MirkinCA.ExosomeEncasedSphericalNucleicAcidGoldNanoparticleConjugatesAsPotentMicroRNARegulationAgents[J].Small,2014,10(1):186-192.)报导纳米金探针可以通过间接方法进入外泌体，但方法操作繁琐且耗时：该实验方法是首先需要通过纳米金探针和细胞共孵2h，使其进入尺寸较大的细胞，然后通过细胞自主形成外泌体的过程中随机地将纳米金探针包裹在外泌体中。为了尽可能的使得纳米金探针进入外泌体中，这个自主包裹过程需24h。尽管如此，由于纳米金探针在细胞中被包裹进入外泌体具有随机性，所以会大大降低纳米金核酸探针进入外泌体的进入率，该文献中纳米金探针进入率<1％。
技术实现思路
本申请的技术正好能够突破上述局限性。本申请的技术可以不借助转染工具而直接进入外泌体中进行核酸检测，进入方法简单且进入率高，平均进入率达2个探针/外泌体以上。由于本申请技术合成的纳米金探针比文献探针的结构上更具优势，使其检测灵敏度更高。本专利技术的目的在于提供一种直接检测外泌体中miRNA-1246的纳米金核酸探针本专利技术的另一目的在于提供上述外泌体中miRNA-1246的纳米金核酸探针的制备方法和应用。本专利技术所采取的技术方案是：一种检测miRNA-1246的纳米金核酸探针，其由纳米金、5'-CCTGCTCCAAAAATCCATTAAAAAAASH-3'和5'-AATGGATTTTTG-3'制成，其中5'-AATGGATTTTTG-3'的序列上标记有荧光基团。优选的，所述荧光基团包括Cy5、Cy7、Cy3、5-TAMRA、TexasRed、Rox、CALFluroRed590、CALFluroRed610、CALFluroRed635、Quasar670、Quasar705、Alexa700。优选的，所述纳米金的粒径不超过14nm，更优选为12.2～13.8nm。一种检测miRNA-1246的纳米金核酸探针的制备方法，将5'-CCTGCTCCAAAAATCCATTAAAAAAA-SH-3'(该序列3'端的“-SH”表示巯基)和5'-AATGGATTTTTG-3'混合，杂交形成DNA双链后，再加入纳米金溶胶，于低温下结冰冷冻，取出得到的冰体，加入氯化钠溶液，在12～22℃条件下解冻，离心取沉淀，并将沉淀用缓冲液清洗干净，得纳米金核酸探针。优选的，所述低温下结冰的温度为-80～-20℃。优选的，所述冷冻时间为1～3h。优选的，所述解冻时间为0.5～1.5h。优选的，所述缓冲液为HEPES缓冲液。优选的，所述5'-AATGGATTTTTG-3'的序列上标记有荧光基团。优选的，所述荧光基团包括Cy5、Cy7、Cy3、5-TAMRA、TexasRed、Rox、CALFluroRed590、CALFluroRed610、CALFluroRed635、Quasar670、Quasar705、Alexa700。优选的，所述5'-CCTGCTCCAAAAATCCATTAAAAAAASH-3'、5'-AATGGATTTTTG-3'、纳米金、氯化钠的摩尔用量比为150～250：150～250：1：3.8×107～4.5×107。优选的，所述纳米金溶胶中纳米金的粒径不超过14nm，优选12.2～13.8nm。优选的，所述纳米金溶胶的制备方法为：将氯金酸溶液和水混本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测miRNA‑1246的纳米金核酸探针，其特征在于，其由纳米金、5'‑CCT GCT CCA AAA ATC CAT TAAAAAAA‑SH‑3'和5'‑AAT GGA TTT TTG‑3'制成，其中5'‑AAT GGA TTT TTG‑3'的序列上标记有荧光基团。

【技术特征摘要】
1.一种检测miRNA-1246的纳米金核酸探针，其特征在于，其由纳米金、5'-CCTGCTCCAAAAATCCATTAAAAAAA-SH-3'和5'-AATGGATTTTTG-3'制成，其中5'-AATGGATTTTTG-3'的序列上标记有荧光基团。2.根据权利要求1所述的一种检测miRNA-1246的纳米金核酸探针，其特征在于，所述纳米金的粒径不超过14nm。3.一种检测miRNA-1246的纳米金核酸探针的制备方法，其特征在于，将5'-CCTGCTCCAAAAATCCATTAAAAAAASH-3'和5'-AATGGATTTTTG-3'混合，杂交形成DNA双链后，再加入纳米金溶胶，于低温下结冰冷冻，取出得到的冰体，加入氯化钠溶液，在12～22℃条件下解冻，离心取沉淀，并将沉淀用缓冲液清洗干净，得纳米金核酸探针。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述5'-AATGGATTTTTG-3'的序列上标记有荧光基团。5.根据权利要求3所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：段文军，翟玲燕，陈云，潘玮伦，黎敏湘，陈金香，孙斌，谢宝平，谢扬，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44