从血红细胞分离的细胞外囊泡和其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种使用源自血红细胞(RBC)的细胞外囊泡(EV)进行RNA递送的方法。该方法包括血红细胞细胞外囊泡的提纯和电穿孔，并将RNA导入细胞外囊泡，同时将载有RNA的细胞外囊泡应用于靶细胞。该方法还包括使用载有RNA的细胞外囊泡治疗癌症。

【技术实现步骤摘要】
从血红细胞分离的细胞外囊泡和其用途序列清单与专利申请一起提交的标题为“序列清单”的序列清单文件具有6,395字节的大小及2017年8月16日的创建日期，其全部内容通过引用并入本文。
本专利技术涉及分子生物学和基因组编辑领域，更具体地涉及通过细胞外囊泡(EV)将遗传物质转移到受体细胞。
技术介绍
包括反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,ASO)、小干扰RNA(siRNA)、合成mRNA和基因组编辑RNA-蛋白质复合物的RNA治疗剂是用于以高特异性和高灵活性靶向人类基因组的新兴治疗方式。ASO和siRNA已作为敲低基因的工具已被广泛地用于生物医学研究中。它们能将任何感兴趣基因沉默从而在靶向疾病重要基因方面具有巨大潜力。可以使用各种化学修饰或缀合来保持ASO和siRNA稳定并增强其结合特异性。用于RNA转染的常用方法包括核转染(nucleofection)、脂质转染(lipofection)和电穿孔(electroporation)，其仅适用于体外递送。病毒转导和纳米颗粒通常用于体内递送RNA和DNA，然而，这些方法通常效率低、具有免疫原性和有毒。科学最新突破之一是基因组编辑的新技术——定期聚集间隔短回文重复(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)方法，其能够对基因组DNA进行稳健和精确的修饰，以广泛地用于多种研究和医学中。CRISPR是纠正癌症遗传异常的理想工具，因为该系统可以设计为直接靶向基因组DNA。CRISPR系统涉及两个主要组分：Cas9酶和指导(gRNA)。gRNA含有用于DNA结合的靶向序列和用于Cas9结合的支架序列。Cas9核酸酶通常用于“敲除”靶基因，因此它可用于删除或抑制对癌症起始或发展必不可少的致癌基因。与ASO和siRNA类似，CRISPR系统在靶向任何感兴趣的基因方面提供了高灵活性，因此可以基于个体患者的基因突变设计潜在的基于CRISPR的疗法。CRISPR系统的一个优点是其完全消除疾病基因表达的能力，这些疾病基因只能通过使用ASO或siRNA的RNA干扰方法部分抑制。此外，可以使用多种gRNA同时抑制或激活多种基因，从而提高治疗效率并降低可能由靶基因中的新突变引起的抗性。CRISPR技术的应用已经从针对不同疾病的工作台快速发展到临床。CRISPR介导的T细胞修饰用于癌症治疗的临床试验已在中国和美国开始。许多其他基于CRISPR的疗法正在开发中。然而，这些疗法中的大多数依赖于靶细胞的体外修饰或使用可靶向极少数细胞类型(例如肝细胞)的病毒或纳米颗粒的CRISPR系统全身递送。急性髓性白血病(AML)是最具攻击性的血癌类型，每年影响近352,000人，5年存活率为1.5％。急性髓性白血病的特征在于外周血(PB)和骨髓(BM)中成髓细胞的增加。30-40％的急性髓性白血病患者(大多数在60岁以下)对化疗和造血干细胞移植反应良好。然而，老年患者的反应率要低得多，因为他们无法忍受化疗的毒性。此外，由于耐药性，几乎所有患者在一定时间后复发。因此，需要新的治疗策略来提高反应率、降低毒性和对抗药物抗性。基因组学的最新进展提供了对急性髓性白血病遗传和表观遗传异常的更好理解，并提出了新的特异性治疗靶点。RNA干扰和基因组编辑方法逐步成为针对这些异常的新方法。然而，已证明向急性髓性白血病细胞递送RNA的基因治疗具有难度，尤其是对于体内治疗。常见的基因治疗递送载体如腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)和脂质纳米颗粒(LNP)在急性髓性白血病模型中大多无效或有毒。因此，需要提高递送效率并降低癌症基因疗法的毒性。
技术实现思路
在本专利技术的一个方面，提供了一种向靶细胞递送RNA的方法，包括以下步骤：a)从血红细胞(RBC)中提纯细胞外囊泡(EV)；b)使用电穿孔使RNA进入所述细胞外囊泡以形成载有RNA的细胞外囊泡；以及c)将载有RNA的细胞外囊泡应用于靶细胞。使用来自血红细胞的细胞外囊泡(包括微泡(microvesicles)和外泌体(exosomes))的优点是血红细胞是最丰富的血细胞，因此可以从任何血库中可获得的血红细胞单位中获得和纯化大量细胞外囊泡。优选地，血红细胞衍生自人类。与合成转染试剂不同，它们是无毒的。血红细胞细胞外囊泡(RBCEV)不含有癌细胞或干细胞的细胞外囊泡中通常含有的致癌DNA/RNA或生长因子，因此血红细胞细胞外囊泡不会对受体细胞产生任何转化风险。在一个实施例中，血红细胞衍生自哺乳动物，优选为人，并经离子载体处理，具体地是经钙离子载体处理。使用蔗糖缓冲(sucrosecushion)超速离心纯化细胞外囊泡。术语“蔗糖缓冲”是指在离心过程中自身建立的蔗糖梯度。在一个实施例中，通过使用约40％至约70％、约50％至约60％或约60％的蔗糖溶液制备蔗糖梯度。在另一个实施例中，电穿孔的细胞外囊泡包含反义寡核苷酸(ASO)、mRNA、短链RNA或质粒。优选地，短链RNA包括gRNA。优选地，反义寡核苷酸包含SEQIDNO：1或由SEQIDNO：1组成。在进一步的实施例中，靶细胞包含癌细胞，或者是癌细胞。在另一个实施例中，靶细胞包括白血病细胞，具体地是急性髓性白血病(AML)细胞、乳腺癌细胞，或急性髓性白血病细胞和乳腺癌细胞的组合。在另一个实施例中，如上所述，利用电穿孔使拮抗miR-125b的反义寡核苷酸进入细胞外囊泡以敲除靶细胞中的miR-125b。优选地，拮抗miR-125b的反义寡核苷酸包含SEQIDNO：1或由SEQIDNO：1组成。在另一个实施例中，抑制了靶细胞的生长。在另一个实施例中，利用电穿孔导入诸如葡聚糖的小分子化合物进入细胞外囊泡。在另一个实施例中，该方法包括向靶细胞施用载有RNA的细胞外囊泡，其调节凋亡相关的基因表达，从而诱导靶细胞中的细胞凋亡。本专利技术也涉及如上所述的细胞外囊泡在制备向靶细胞递送RNA的药物的用途。具体地，靶细胞和RNA如上所述。在本专利技术的第二方面，提供了一种向靶细胞递送反义寡核苷酸以抑制基因表达的方法，包括以下步骤：a)从血红细胞中提纯细胞外囊泡；b)利用电穿孔使RNA进入所述细胞外囊泡以形成载有RNA的细胞外囊泡；以及c)将载有RNA的细胞外囊泡应用于所述靶细胞。在一个实施例中，利用电穿孔使Cas9mRNA和gRNA进入细胞外囊泡。在一个实施例中，利用电穿孔使能转录Cas9mRNA和gRNA的质粒进入细胞外囊泡。在一个实施例中，如上所述，血红细胞衍生自哺乳动物，优选为人，并经离子载体处理，特别是经钙离子载体处理。在一个实施例中，RNA是拮抗miR-125b的反义寡核苷酸，以抑制靶细胞中的致癌miR-125b。优选地，拮抗miR-125b的反义寡核苷酸包含SEQIDNO：1或由SEQIDNO：1组成。在另一个实施例中，靶细胞包含癌细胞或是癌细胞。在另一个实施例中，靶细胞包含白血病细胞，特别是急性髓性白血病细胞、乳腺癌细胞，或急性髓性白血病细胞和乳腺癌细胞的组合。可理解的是，本专利技术也涉及如上所述的细胞外囊泡在制备向靶细胞递送反义寡核苷酸以抑制基因表达的药物的用途。具体地，反义寡核苷酸、靶细胞和RNA如上所述。在本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于向靶细胞递送RNA的方法，包括：a)从血红细胞提纯细胞外囊泡；b)利用电穿孔使RNA进入细胞外囊泡，以形成载有RNA的细胞外囊泡；以及c)将所述载有RNA的细胞外囊泡应用于所述靶细胞。

【技术特征摘要】
2017.08.16 US 15/678,3631.一种用于向靶细胞递送RNA的方法，包括：a)从血红细胞提纯细胞外囊泡；b)利用电穿孔使RNA进入细胞外囊泡，以形成载有RNA的细胞外囊泡；以及c)将所述载有RNA的细胞外囊泡应用于所述靶细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血红细胞衍生自人类并经钙离子载体处理。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞外囊泡通过使用蔗糖缓冲超速离心以从处理过的血红细胞中纯化。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA包括反义寡核苷酸、mRNA或短链RNA。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞包括癌症细胞。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞包括急性髓性白血病细胞、乳腺癌细胞，或急性髓性白血病细胞和乳腺癌细胞的组合。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用电穿孔使拮抗miR-125b的反义寡核苷酸进入细胞外囊泡。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞的生长受到抑制。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用电穿孔导入小分子化合物进入细胞外囊泡中。10.如权利要求1所述的方法，包括向所述靶细胞施用载有RNA的细胞外囊泡，其调节凋亡相关的基因表达，从而在所述靶细胞中诱导细胞凋亡。11.一种向靶细胞递送反义寡核苷酸以抑制基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括：a)从血红细胞中提纯细胞外囊泡；b)利用电穿孔刺激细胞外囊泡，使RNA进入细胞外囊泡以形成载有RNA的细胞外囊泡；以及c)将所述载有RNA的细胞外囊泡应用于所述靶细...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎月明，史家海，M·瓦卡斯，
申请(专利权)人：香港城市大学，
类型：发明
国别省市：中国香港,81