本发明专利技术公开了一种羧甲基茯苓多糖CMP44及其制备方法与应用。所述制备方法利用DEAE‑52纤维素层析柱、Sephadex‑G200+Sephadex‑G150层析柱联用，对现有羧甲基茯苓粗多糖进行分离纯化，以0.2mol/L NaCl溶液为洗脱液得到CMP44。本发明专利技术制得的羧甲基茯苓多糖CMP44具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎及免疫调节的活性，可应用于功能食品与生物制药领域。
A carboxymethyl Poria cocos polysaccharide CMP44 and its preparation method and Application
The invention discloses a carboxymethyl Poria cocos polysaccharide CMP44 and a preparation method and application thereof. The preparation method utilizes DEAE 52 cellulose chromatography column, Sephadex G200+Sephadex G150 chromatography column to separate and purify the existing crude carboxymethyl Poria cocos polysaccharide, and CMP44 is obtained with 0.2 mol/L NaCl solution as eluent. The carboxymethyl Poria cocos polysaccharide CMP44 prepared by the invention has antioxidant, anti-tumor, anti-inflammatory and immunomodulatory activities, and can be applied in the field of functional food and biopharmaceuticals.
【技术实现步骤摘要】
一种羧甲基茯苓多糖CMP44及其制备方法与应用
本专利技术属于功能食品与生物制药领域，具体涉及一种羧甲基茯苓多糖CMP44及其制备方法与应用。
技术介绍
茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，收载于《中国药典》，位列中药“四君八珍”之中，别称玉灵、茯灵、松苓、茯菟等，具有很高的食补和药用价值，具有祛湿利尿、健脾和胃、安神宁心等功效，是一种药食两用的传统中药材。茯苓多糖为茯苓的主要有效成分，占茯苓菌核的80％以上。茯苓多糖经羧甲基化改性可得到水溶性羧甲基茯苓多糖，具有抗肿瘤、抗炎、免疫增强等作用。目前，对于茯苓多糖羧甲基化改性、纯化以及评价其生物活性，并分析其构效关系等系统的研究工作仍处于起步阶段，尤其是对纯化羧甲基茯苓多糖的抗炎作用的研究鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术以羧甲基茯苓粗多糖为原料，利用离子交换层析柱和葡聚糖凝胶层析柱分离纯化多糖，并对纯化组分CMP44进行了结构鉴定，验证了其体外抗氧化活性、抗肿瘤活性以及体外抗炎活性。本专利技术的目的是提供一种具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎及免疫调节活性的羧甲基茯苓多糖CMP44及其制备方法与应用。本专利技术采用的羧甲基茯苓多糖可以用已经公开的中国专利申请(申请号：201510905843.0)记载的任一制备方法制得，例如可以包括以下步骤：(1)制备茯苓碱液：将茯苓粉碎，加水浸泡，然后加入氢氧化钠或氢氧化钾，将茯苓溶解完后得茯苓碱液；(2)脱色、取代反应：将双氧水缓慢加入茯苓碱液中，然后往脱色完成后的茯苓碱液中加入固体状氯乙酸，进行羧甲基取代反应，得羧甲基茯苓多糖碱液；(3)中和、醇沉：将乙醇与冰醋酸混合，得到乙醇醋酸溶液，将步骤(2)得到的羧甲基茯苓多糖碱液与乙醇醋酸溶液混合，羧甲基茯苓多糖沉淀析出，过滤收集沉淀，将沉淀用乙醇洗涤、干燥得到羧甲基茯苓多糖。若有未特别详细说明之参数，可以参照该申请文献。本专利技术的目的至少通过如下技术方案之一实现。一种羧甲基茯苓多糖CMP44的制备方法，所述多糖是利用DEAE-52纤维素层析柱、Sephadex-G200+Sephadex-G150层析柱联用，对现有羧甲基茯苓粗多糖进行分离纯化，以0.2mol/LNaCl溶液为洗脱液得到羧甲基茯苓多糖CMP44。进一步地，所述羧甲基茯苓多糖CMP44的制备方法包括：羧甲基茯苓粗多糖溶于超纯水中上DEAE-52纤维素离子交换层析柱纯化，用NaCl溶液洗脱，苯酚-硫酸法进行跟踪检测，收集洗脱峰，真空浓缩，透析后冷冻干燥，制得羧甲基茯苓多糖CMP3。再将CMP3溶于超纯水中上Saphadex-G200和Saphadex-G150层析柱进一步纯化，NaCl溶液洗脱，真空浓缩，透析后冷冻干燥，制得羧甲基茯苓多糖CMP44。进一步地，所述现有羧甲基茯苓粗多糖由中国专利文献CN105348407A公开的羧甲基茯苓多糖的制备工艺制得。进一步地，所述多糖CMP44的单糖组成为D-葡萄糖，分子量为20.96×104Da，结构为(1→3)-β-D-葡聚糖，含(1→6)和(1→2)糖苷键，具有三螺旋结构。由所述一种羧甲基茯苓多糖CMP44的制备方法制得的羧甲基茯苓多糖CMP44。所述多糖CMP44具有体外抗氧化活性，CMP44对DPPH·、ABTS+、·OH的EC50值分别为4.85mg/mL、4.83mg/mL、2.94mg/mL。进一步地，所述多糖CMP44在31.25-1000μg/mL浓度范围内对结肠癌细胞HT-29、肝癌细胞HepG-2、乳腺癌细胞MCF-7、胃癌细胞SGC-7901以及肺癌细胞A549细胞增殖体现出抑制作用，对应的IC50值分别为140.5、264.3、256.4、102.5、313.2μg/mL。进一步地，所述多糖CMP44能抑制脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7释放一氧化氮(NO)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白介素-1β(IL-1β)，在31.25-1000μg/mL浓度范围内，对LPS诱导的NO、IL-6、TNF-α及IL-1β生成的抑制率分别46.87％、44.33％、79.48％及34.72％，具有抗炎活性。进一步地，所述多糖CMP44无LPS诱导时可激活RAW264.7细胞分泌NO、IL-6、TNF-α及IL-1β，31.25-1000μg/mL浓度范围内对其分泌量最大值分别是对照组的3.17倍、13.37倍、2.34倍及8.50倍，具有免疫调节作用。本专利技术提供的所述多糖CMP44能在制备功能食品与生物制药中应用，多糖CMP44具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎及免疫调节活性。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和技术效果：本专利技术除使用DEAE-52纤维素层析柱之外，更重要的是使用了Sephadex-G200+Sephadex-G150两种层析柱联用，对羧甲基茯苓粗多糖进行分离纯化，以0.2mol/LNaCl溶液为洗脱液得到CMP44。实验表明，本专利技术制得的CMP44是一种具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎及免疫调节活性的多糖。附图说明图1为DEAE-52纤维素层析柱洗脱曲线(横坐标为管数，纵坐标为吸光度值)。图2为Sephadex-G200和Sephadex-G150葡聚糖凝胶层析柱洗脱曲线。图3为CMP44的HPGPC色谱图(横坐标为时间min，纵坐标为电压mv)。图4为CMP44红外光谱图(横坐标为波数，纵坐标为透过率)。图5为混合标准品(A)的GC图。图6a、图6b分别为混合标准品(A)和CMP44(B)的Smith降解产物GC图。图7a、图7b分别为CMP44的1H(A)和13C(B)NMR图(横坐标是化学位移)。图8为不同碱浓度下CMP44与刚果红混合液的最大吸收波长变化对比图(横坐标为NaOH的浓度,纵坐标为最大吸收波长)。图9a、图9b为CMP44对RAW264.7细胞增殖的影响(x±s，n＝5)对比图(横坐标为浓度，纵坐标为RAW264.7细胞的相对活度)。图10a、图10b为CMP44对RAW264.7细胞释放NO的影响(x±s，n＝5)对比图(横坐标为浓度，纵坐标为NO的浓度)。具体实施方式以下结合具体实例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术的实施和保护范围不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程或参数，均是本领域技术人员可参照现有技术理解或实现的。羧甲基茯苓多糖的纯化羧甲基茯苓粗多糖100-300mg溶于1-10mL超纯水中上DEAE-52纤维素离子交换层析柱纯化，用0.2mol/LNaCl溶液洗脱，流速为0.45mL/min，12min/管收集，苯酚-硫酸法进行跟踪检测，收集洗脱峰，真空浓缩，透析后冷冻干燥，制得羧甲基茯苓多糖CMP3。再将CMP350-150mg溶于1-5mL超纯水中上Saphadex-G200和Saphadex-G150层析柱进一步纯化，0.2mol/LNaCl溶液洗脱，流速为0.3mL/min，10min/管收集，真空浓缩，透析后冷冻干燥，制得羧甲基茯苓多糖CMP44。羧甲基茯苓多糖结构鉴定纯度测定：CMP44样品10mg溶于100mL蒸馏水，取1.0mL待测液于25mL比色管中，补加蒸馏水至2.00mL，再加入5％(质量浓度)苯酚溶液1mL，混合摇匀本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种羧甲基茯苓多糖CMP44的制备方法，其特征是所述多糖是利用DEAE‑52纤维素层析柱、Sephadex‑G200+Sephadex‑G150层析柱联用，对现有羧甲基茯苓粗多糖进行分离纯化，以0.2mol/L NaCl溶液为洗脱液得到羧甲基茯苓多糖CMP44。
【技术特征摘要】
1.一种羧甲基茯苓多糖CMP44的制备方法，其特征是所述多糖是利用DEAE-52纤维素层析柱、Sephadex-G200+Sephadex-G150层析柱联用，对现有羧甲基茯苓粗多糖进行分离纯化，以0.2mol/LNaCl溶液为洗脱液得到羧甲基茯苓多糖CMP44。2.如权利要求1所述的一种羧甲基茯苓多糖CMP44的制备方法，其特征在于所述现有羧甲基茯苓粗多糖由中国专利文献CN105348407A公开的羧甲基茯苓多糖的制备工艺制得。3.如权利要求1所述的一种羧甲基茯苓多糖CMP44的制备方法，其特征在于所述多糖CMP44的单糖组成为D-葡萄糖，分子量为20.96×104Da，结构为(1→3)-β-D-葡聚糖，含(1→6)和(1→2)糖苷键，具有三螺旋结构。4.由权利要求1～3任一项所述一种羧甲基茯苓多糖CMP44的制备方法制得的羧甲基茯苓多糖CMP44。5.如权利要求4所述的一种羧甲基茯苓多糖CMP44，其特征在于所述多糖CMP44具有体外抗氧化活性，CMP44对DPPH、·ABTS+、·OH的EC50值分别为4.85mg/mL、4.83mg/mL、2.94mg/mL。6.如权利要求1所述的一种羧甲基茯苓多糖CMP44，其特征是所述多...
【专利技术属性】
技术研发人员：张学武，刘晓菲，徐晓飞，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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