一种腐败梭菌α毒素基因工程疫苗及其生产方法技术

本发明专利技术专利制备的腐败梭菌CSA基因工程疫苗，系采用经过密码子优化的，在含有4个氨基酸突变(C54L，N264A，H269A和W310A)的基础上缺失了11个氨基酸(第212位～第222位)的重组腐败梭菌CSA(rCSAM4Δ11)生产，即最大限度地保留天然毒素的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了因少数氨基酸突变带来的生物安全隐患。同时，无毒的rCSAM4Δ11能够以可溶性的形式表达，从而避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本。此外，该疫苗还具有免疫剂量低、免疫效力好等优点，是现行腐败梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗。

A Clostridium putrefaciens alpha toxin genetic engineering vaccine and its production method

The patented CSA genetic engineering vaccine of Clostridium putrefaciens prepared by the invention is coded optimized, and 11 amino acids (212-222) are deleted on the basis of 4 amino acid mutations (C54L, N264A, H269A and W310A), i.e., the integrity and spatial conformation of natural toxins are kept to the maximum extent, so as to maintain its immunogen. Sex also avoids the potential biological safety hazards caused by a few amino acid mutations. At the same time, the non-toxic rCSAM4 11 can be expressed in a soluble form, thus avoiding the cumbersome process of inclusion body denaturation and renaturation on the immunogenicity of antigen proteins, and reducing the preparation time and production cost of the vaccine. In addition, the vaccine has the advantages of low immune dose and good immune efficacy. It is an ideal candidate for the upgrading of Clostridium putrefaciens toxin vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种腐败梭菌α毒素基因工程疫苗及其生产方法
本专利技术涉及一种腐败梭菌α毒素基因工程疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
腐败梭菌是一种能够引起人以及牛、羊、马、猪、水貂、鸡等多种动物发病的厌氧菌，对人类的健康和畜禽养殖业危害极大，羊经由消化道感染该菌，引起的羊快疫(Braxy)是一种常见、多发、非接触、急性和致死性传染病。由于腐败梭菌引起的疾病病程短促，如不及时对症治疗，动物会迅速死亡，而免疫接种是预防这类疫病最有效的途径。目前，使用的商品化疫苗主要为灭活疫苗，在预防动物腐败梭菌所致疾病方面虽然取得了一定的效果，但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应等；其在制备过程中涉及外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患；此外，培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，接种动物易产生不良反应，导致免疫效果下降甚至免疫失败。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的腐败梭菌毒素基因工程疫苗，是未来的发展方向。在腐败梭菌分泌的多种毒力因子中，α毒素(CSA)是一种关键的致死性毒力因子，并且与致病性有直接的关系。CSA由440或443个氨基酸构成，主要分为D1、D2和D3三个结构域。其中，D1结构域是一个复杂的多功能结构域，在受体结合，寡聚化和孔形成过程中均发挥作用，该结构域内45个关键性氨基酸位点突变的突变体中，有17种突变体丧失细胞溶血活性，而细胞结合活性则各不相同。根据上述的研究内容，本课题组前期申请的专利“一种腐败梭菌CSA重组亚单位疫苗及其生产方法”(申请号或专利号：201710981433.3)获得了含有4个氨基酸突变(第54位半胱氨酸突变为亮氨酸C54L，第264位天冬酰胺突变为丙氨酸N264A，第269位组氨酸突变为丙氨酸H269A，第310位色氨酸突变为丙氨酸W310A)的CSA重组蛋白(rCSAM4)，结果显示，rCSAM4以非可溶(包涵体)形式表达，经纯化复性的rCSAM4毒力基本丧失，但仍保留了较好的免疫原性。D2结构域主要参与孔形成过程，而D3结构域主要参与毒素分子的寡聚化。已有的研究发现，删除位于D2区的双亲性β发夹跨膜区内的11个氨基酸(第212位～第222位)不会明显改变CSA的正常折叠，但使CSA完全丧失细胞毒性和其在腐败梭菌病中的作用，而该重组毒素的抗原性未得到验证。
技术实现思路
本专利技术目的在于制备出腐败梭菌CSA基因工程疫苗，用于预防由腐败梭菌感染引起的疾病。本专利技术技术方案1.一种腐败梭菌CSA基因工程疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠埃希氏菌表达的重组CSA；制苗用菌种为重组表达CSA的大肠埃希氏菌被命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BLc1株，该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.15236。2.本专利技术所述腐败梭菌CSA基因工程疫苗，其特征在于所述重组CSA，与野生型CSA成熟毒素相比，含有4个氨基酸突变，分别是：第54位半胱氨酸突变为亮氨酸，第264位天冬酰胺突变为丙氨酸，第269位组氨酸突变为丙氨酸，第310位色氨酸突变为丙氨酸；与野生型CSA成熟毒素相比，含有第212位～第222位共11个氨基酸的缺失，同时，在C末端加上6个组氨酸标签。3.本专利技术所述腐败梭菌CSA基因工程疫苗，其特征在于所述重组CSA，其重组表达载体的基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高效表达与可溶性表达。4.本专利技术所述腐败梭菌CSA基因工程疫苗，其特征在于所述重组CSA同时失去细胞结合活性和细胞穿孔活性，从而成为无毒突变体，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。5.本专利技术所述腐败梭菌CSA基因工程疫苗，其特征在于所述重组CSA，其C末端含有6个组氨酸(6*His)标签，便于蛋白的纯化。6.本专利技术所述腐败梭菌CSA基因工程疫苗的制备方法，其特征在于用所述表达CSA重组蛋白的大肠埃希氏菌BLc1株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、上清分离纯化后，加双相油乳佐剂混合制成。本专利技术具体实施方式1.腐败梭菌CSA基因工程疫苗的制备(1)菌种：制苗用菌种为重组表达腐败梭菌CSA的大肠埃希氏菌BLc1株，该菌种表达的腐败梭菌CSA同时含有4个氨基酸位点的突变(C54L，N264A，H269A和W310A)和11个氨基酸的缺失(第212位～第222位)，且重组蛋白的C末端添加了6个组氨酸标签。该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.15236；由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。(2)一级种子繁殖及鉴定：将冻干菌种用少量LB液体培养基融解，划线接种于含卡那霉素的LB固体平板，置37℃培养12～16h，选取符合标准的单个菌落，接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃培养8～12h，与50％甘油等比例混合后分装，经纯粹检验合格后，作为制苗用一级种子。(3)二级种子繁殖及鉴定：取一级种子，按1％的量接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃振荡培养8～12h，即为二级种子。(4)制苗用抗原制备：取合格的二级种子，按培养基总量的2％接种含卡那霉素的LB液体培养基，发酵罐内培养。设置培养参数为：培养温度37℃，pH值7.0，溶氧40％。当培养物OD600值为10～15时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导培养4h。(5)破菌：离心收集菌体，按每克菌体湿重加10mL裂解液(pH值7.2、0.02mol/LTris缓冲液，0.3mol/LNaCl)的比例重悬菌体，4℃条件下用低温高压均质机以800bar的压力破碎菌体3次。裂解液经4℃10000r/min离心30min，弃去沉淀，收集上清液。(6)纯化：按向收集的上清中加入饱和硫酸铵至30％饱和度，充分混合，2～8℃静置4h，离心收集沉淀。用与硫酸铵沉淀前上清等体积的缓冲液(pH值6.0、0.01mol/L磷酸缓冲液)重悬沉淀，离心后收集上清，经0.22μm孔径滤膜过滤。(7)蛋白含量检测：用BCA法检测蛋白含量。应不低于0.4mg/mL。经SDS-PAGE检测并对条带进行灰度扫描，蛋白纯度应不低于60％。(8)无菌检验：按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)附录进行。应无菌生长。(7)疫苗配制：将双相油佐剂(如201佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30min，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用PBS(pH值7.2、0.01mol/L)将检验合格的纯化蛋白适当稀释后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(V/V)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装。2.腐败梭菌CSA基因工程疫苗的检验(1)性状外观乳白色乳剂。剂型呈水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种腐败梭菌α毒素(CSA)基因工程疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌表达的重组腐败梭菌CSA；制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌CSA的大肠埃希氏菌被命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BLc1株，该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.15236。

【技术特征摘要】
1.一种腐败梭菌α毒素(CSA)基因工程疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌表达的重组腐败梭菌CSA；制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌CSA的大肠埃希氏菌被命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BLc1株，该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.15236。2.如权利要求1所述腐败梭菌CSA基因工程疫苗，其特征在于所述重组腐败梭菌CSA，与野生型腐败梭菌CSA成熟毒素相比，不仅含有4个氨基酸突变(第54位半胱氨酸突变为亮氨酸，第264位天冬酰胺突变为丙氨酸，第269位组氨酸突变为丙氨酸，第310位色氨酸突变为丙氨酸)，而且含有11个氨基酸(第212位～第222位)的缺失，同时...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜吉革，陈小云，薛麒，朱真，李启红，印春生，康凯，姚文生，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11