一种HER2融合单链抗体、制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种HER2融合单链抗体、制备方法与应用。该HER2单链抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还提供了一种融合单链抗体，由多肽片段的C端通过接头的方式与所述的HER2单链抗体的N端连接而成；其中，所述的多肽片段为苹果酸脱氢酶的片段或细胞色素氧化酶的片段。该融合单链抗体与HER2单链抗体有相同的亲和活性，且对HER2阳性乳腺癌细胞BT474的杀伤效果显著提高，而对HER2阴性乳腺癌细胞MCF‑7生长无影响，可用于抗癌药物的制备中。

A HER2 Fusion Single Chain Antibody, Its Preparation and Application

The invention discloses a HER2 fusion single chain antibody, a preparation method and application. The HER2 single chain antibody contains heavy chain variable region and light chain variable region. The nucleotide sequence of the heavy chain variable region is shown in SEQ ID NO.1 and the nucleotide sequence of the light chain variable region is shown in SEQ ID NO.2. The invention also provides a fusion single-chain antibody, which is formed by connecting the C terminal of the polypeptide fragment with the N terminal of the HER2 single-chain antibody by means of a joint, wherein the polypeptide fragment is a fragment of malic dehydrogenase or a fragment of cytochrome oxidase. The fusion single-chain antibody has the same affinity with HER2 single-chain antibody, and its killing effect on HER2-positive breast cancer cell BT474 is significantly improved, but it has no effect on the growth of HER2-negative breast cancer cell MCF 7. It can be used in the preparation of anticancer drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种HER2融合单链抗体、制备方法与应用
本专利技术属于生物
和医学领域，特别涉及一种HER2融合单链抗体、制备方法与应用。
技术介绍
2014年世界卫生组织国际癌症研究中心最新数据统计显示，全球每年约140万女性发生乳腺癌，病死率高达33％。我国乳腺癌的发病率居女性恶性肿瘤首位，病死率仅次于肺癌，严重影响女性的生活质量和生存寿命。目前，乳腺癌治疗方法主要有：新辅助治疗、手术治疗、辅助放化疗、内分泌治疗和靶向治疗。近年来，靶向治疗能够使患者更大程度的获益，与化疗相辅相成，且釆用化学方法连接抗体和药物，合成抗体偶联物已成为研究热点，既能特异性地识别肿瘤细胞，又能高效地杀死靶细胞，从而达到高效低毒的治疗目的。基因过度表达可导致细胞过度增殖和表型恶性转化，在肿瘤中会出现不同的基因表型，而这些基因表型对肿瘤的治疗提供有效的靶点。HER2是一种酪氨酸激酶受体，在25％～30％乳腺癌中过表达，且与肿瘤的侵袭性及患者的预后相关。1998年美国FDA批准靶向HER2的人源化单克隆抗体曲妥珠单抗(Trastuzumab，Herceptin)上市，Trastuzumab在临床上的成功应用促进了以HER2单克隆抗体为导向的单抗靶向药物研究。已有超过30种的单克隆抗体药物被批准用于临床治疗。以低排斥反应等优点的人源化及全人抗体近年来发展迅速，在FDA批准的抗体药物中已占80％以上，已成为抗体药物发展的主要趋势。但由于大分子蛋白的人源化及全人抗体具有很强的免疫原性，影响了治疗效果。单链片段抗体技术则克服了这些缺点，单链抗体是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的肽连接而成的重组蛋白，与完整抗体相比，其保持了抗原亲和活性。由于它的分子量小，组织穿透能力强，较易穿透细胞外间隙到达深部的肿瘤细胞；由于它缺乏Fc段，丧失完整抗体的效应功能如抗体依赖细胞毒作用(ADCC)或补体依赖细胞毒作用(CDCC)使得免疫原性较弱，日益成为诊断和治疗的良好导向载体；因此，如何充分利用单链片段抗体的靶向功能是目前研究的重点。临床试验结果表明，由美国Genentech公司开发靶向HER2的人源化单克隆抗体曲妥珠单抗(Trastuzumab，Herceptin)，单独应用时有效率为11.6％～16％。由于抗肿瘤抗体能特异性的识别肿瘤细胞，但较低的杀伤能力而使其抗肿瘤效果不佳；因此，如何提高抗体的靶向性及细胞毒性作用成为目前亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种HER2单链抗体。本专利技术的另一目的在于提供一种融合单链抗体。本专利技术的又一目的在于提供所述的HER2单链抗体或所述的融合单链抗体的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供所述的HER2单链抗体或所述的融合单链抗体的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种HER2单链抗体(scFv)，包含重链可变区和轻链可变区，编码所述的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；编码所述的轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。所述的重链可变区和轻链可变区指单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区；所述的单克隆抗体为曲妥珠单抗。由于单链抗体的生物活性是由抗体轻链和重链可变区中的高变区特异性的基因序列决定的，因此，可通过基因工程方法对如上提供的编码重链可变区和编码轻链可变区的核苷酸序列进行重组，得到不同类型的抗体。所述的HER2单链抗体，由重链可变区、连接链和轻链可变区组成，编码所述的HER2单链抗体的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。所述的连接链的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。编码所述的连接链的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。一种融合单链抗体，由多肽片段(LP)C端通过接头(Linker)与所述的HER2单链抗体的N端连接而成；其中，所述的多肽片段为苹果酸脱氢酶(Malatedehydrogenase，MDH)的片段(LP1)或细胞色素氧化酶(Cytochromeoxidase，COX)的片段(LP2)。所述的苹果酸脱氢酶的片段的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。所述的细胞色素氧化酶的片段的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。编码所述的苹果酸脱氢酶的片段的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。编码所述的细胞色素氧化酶的片段的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。所述的接头的氨基酸序列的长度为2～50个氨基酸，优选为4～20个氨基酸。连接肽长度可以短至多肽与单链抗体之间形成的位阻保持最小；优选G4S最为有利于多肽片段与单链抗体片段之间的相连。所述的融合单链抗体通过生物膜层干涉技术(BLI)测定的亲和力与所述的HER2单链抗体是相当的；同时，该融合单链抗体对HER2阳性细胞BT474具有明显的杀伤作用，对HER2阴性细胞MCF-7无影响。所述的HER2单链抗体或所述的融合单链抗体的制备方法，包括如下步骤：将编码目标基因的核苷酸序列克隆入表达载体构建重组表达载体；将所述的重组表达载体转入表达系统中，将得到的阳性转化子进行发酵表达，分离纯化后复性得到所述的HER2单链抗体或所述的融合单链抗体。所述的目标基因的核苷酸序列为编码所述的HER2单链抗体的核苷酸序列或编码所述的融合单链抗体的核苷酸序列。所述的编码所述的融合单链抗体的核苷酸序列通过OverLapPCR技术扩增得到。当所述的融合单链抗体中的多肽片段为苹果酸脱氢酶的片段，接头为G4S时，所述的OverLapPCR技术的引物优选为：LP1-scFv-F15-TATTTACCACATGATGCTGTCCGC-3，斜体字体表示酶切位点NdeⅠ；LP1-scFv-R15-AGATTGTAATAATTGTACTTGGCATGCGCTGCCACCGCCACCATTGT-3，下划线表示接头G4S；LP1-scFv-F25-ACAATGGTGGCGGTGGCAGCGCATGCCAAGTACAATTATTACAA-3，下划线表示接头G4S；LP1-scFv-R25-ACGTTAGATCTCCTCCTAATACTGT-3，斜体字体表示BamHI。当所述的融合单链抗体中的多肽片段为细胞色素氧化酶的片段时，所述的Over-LapPCR技术的引物优选为：LP2-scFv-F15-TATTTACCACATGATGGCCAGCCG-3，斜体字体表示酶切位点NdeⅠ；LP2-scFv-R15-AGATTGTAATAATTGTACTTGGCATGCAGAGCCGCCACCGCCCAT-3，下划线表示接头G4S；LP2-scFv-F25-CATGGGCGGTGGCGGCTCTGCATGCCAAGTACAATTATTACAATCT-3，下划线表示接头G4S；LP2-scFv-R25-ACGTTAGATCTCCTCCTAATACTGT-3,斜体字体表示BamHI。所述的表达载体优选为质粒pET28a；所述的构建重组表达载体的具体步骤为：用限制性内切酶NdeⅠ、BamHⅠ分别酶切质粒pET28a和目标基因的核苷酸序列后，连接构建得到所述的重组表达载体。所述的表达系统优选为大肠杆菌表达系统；进一步优选为大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)。所述的发酵表达的具体步骤为：将所述的阳性转化子接种到含卡那霉素的LB培养基中，过夜培养后，按本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HER2单链抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于：编码所述的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种HER2单链抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于：编码所述的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；编码所述的轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的HER2单链抗体，其特征在于：由重链可变区、连接链和轻链可变区组成，编码所述的HER2单链抗体的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。3.一种融合单链抗体，其特征在于：由多肽片段的C端通过接头的方式与权利要求1～2任一项所述的HER2单链抗体的N端连接而成；其中，所述的多肽片段为苹果酸脱氢酶的片段或细胞色素氧化酶的片段。4.根据权利要求3所述的融合单链抗体，其特征在于：所述的苹果酸脱氢酶的片段的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。5.根据权利要求3所述的融合单链抗体，其特征在于：所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雷，李杉，李俊敏，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44