一种甜菜叶石蜡包埋制片的方法技术

本发明专利技术属于植物制片技术领域，公开了一种甜菜叶石蜡包埋制片的方法；取材与固定，将材料进行分割，置于广口瓶，固定处理24h；脱水与透明：脱水2h，透明1.5h；染色采用番红、固绿对染；石蜡精炼：浸蜡用75℃恒温箱进行；包埋采用半自动包埋机进行包埋，将材料放入包埋盒后摆好材料的位置，再将包埋盒放在碎冰机制成的冰块上，迅速冷却；修块、切片、粘片与脱蜡；封片：湿封，在自然风干。本发明专利技术明确甜菜叶的内部组织结构，对取材与固定、脱水与透明、熔蜡、浸蜡与包埋，切片、粘片、染色、制片等关键环节进行了优化，节省时间提高制片效率和成功率。

【技术实现步骤摘要】
一种甜菜叶石蜡包埋制片的方法
本专利技术属于植物制片
，尤其涉及一种甜菜叶石蜡包埋制片的方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：甜菜的主要产品是糖。糖是人民生活不可缺少的营养物质，也是食品工业，饮料工业和医药工业的重要原料。除生产蔗糖外，甜菜及其副产品还有广泛开发利用前景。甜菜叶是甜菜的主要生长发育器官，主要起光合作用，叶柄组织切片观察表皮层结构紧密，叶柄维管柱结构清晰完整，木质部、形成层、韧皮部清晰可辩，导管和管胞被染成红色，为成熟的木质化的细胞。石蜡切片技术因其具有经济、方便、适用、简便、易操作、设备要求不高、材料可长期保存等优点，该技术在组织学和病理学常规制片技术中成为最为广泛的应用，在植物的科学技术研究领域扮演着十分重要的角色。但是，石蜡切片制作过程经常存在切片不成带、弯曲、出现裂纹、皱缩、不粘片、脱落、薄厚不匀等诸多问题，在不同作物、同一种作物不同器官、同一器官不同发育阶段的每一环节所采取的方法都不同，在实际操作过程中均不能照搬实验指导或者文献资料，而需要进行反复摸索才可以制得一个理想的片子。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)现有技术的石蜡切片制作过程，经常存在切片不成带、弯曲、出现裂纹、皱缩、不粘片、脱落、薄厚不匀。(2)现有技术中在不同作物、同一种作物不同器官、同一器官不同发育阶段的每一环节所采取的方法都不同，带来巨大的工作量，使得工作效率降低。解决上述技术问题的方法和意义：切片刀口不锋利、蜡块与刀口平行角度不正确，是不能切成连续蜡带的主要原因。应注意刀口锋利度与蜡块的正确位置。蜡带上材料出现空洞是由于石蜡没有完全浸入材料应重新浸蜡。蜡带皱缩的原因是由于石蜡太软，融点较低或切片时温度过高所致。因此，在夏天切片宜用融点较高的石蜡。另外，切片过薄低于5微米需要低温否则也容易皱缩。切片较厚在12微米以上，如果石蜡太硬则易碎裂。蜡带弯曲是由于蜡块的上下两边修块不平行，而无法平展。蜡带出现裂纹或裂缝，是切片刀口某处有小口或切片刀已钝。应移动切片刀的位置。注意用毛笔刷去刀刃上的蜡屑。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种甜菜叶石蜡包埋制片的方法，本专利技术是这样实现的，一种甜菜叶石蜡包埋制片的方法，具体包括以下步骤：步骤一：取材与固定：将材料进行分割，置于广口瓶，固定24h；步骤二：脱水与透明：脱水2h，透明1.5h；步骤三：染色：采用番红、固绿对染；染色在纯酒精：纯二甲苯比例为1:1透明过程中加入染色剂，进行染色；步骤四：石蜡精炼：浸蜡用75℃恒温箱进行，分别标记为蜡杯Ⅰ，蜡杯Ⅱ，蜡杯Ⅲ；步骤五：包埋：采用半自动包埋机进行包埋，将材料放入包埋盒后摆好材料的位置，再将包埋盒放在碎冰机制成的冰块上，迅速冷却；步骤六：修块、切片、粘片与脱蜡：将载玻片涂上一层粘片剂，滴一滴40℃左右的温水，将切好的蜡带用解剖针挑起放到上边，使切片展开，然后放到40℃烘箱或展片机上烘干，烘1h以上或更长时间；步骤七：封片：湿封，先将加拿大树胶滴在组织的边缘位置，然后将盖玻片倾斜盖在胶液上，再将胶液压至组织上，让其自然风干。进一步，步骤一中，分割材料，分割为3～5mm.固定于250毫升广口瓶，每瓶放置5～10个材料，固定24h。进一步，步骤三中，染色剂量：1～2滴。进一步，步骤四中，石蜡选用54～56，熔点53～57规格的石蜡进行包埋。进一步，步骤六中，夏天高温季节切片之前，先将蜡块放入冰箱中冰冻处理，保持石蜡的硬度；当室内干燥时，增加室内湿度。进一步，步骤六中，粘片剂为1:1体积比的鸡蛋清：甘油，如：100mL蛋清加100mL甘油，注意；蛋清应打成细沫状。配置好后的粘片剂过滤备用。进一步，步骤六中，脱蜡，夏天高温时，每一步骤3～5min；冬季低温时，延长时间或提高室内温度。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术明确甜菜叶的内部组织结构，对取材与固定、脱水与透明、熔蜡、浸蜡与包埋，切片、粘片、染色、制片等关键环节进行了优化，节省时间提高制片效率和成功率。与现有技术相比，本专利技术有以下优势：(1)选择材料：用于制片的材料，应注意选材适当，为了获得理想的观察效果，应该选择正确、健康、标准的实验材料。如果为了观察特定结构，则可选要观察的特定的发育部位。实验标本不要损伤或者变干，取材应立即放入标本箱或盛有固定液的广口瓶中或用湿纸包裹带回实验室固定。(2)材料固定；切取材料压力不能过大，以免压坏组织。为了使固定液迅速渗入材料，因此所截取的体积不宜过大，圆柱状的材料，直径超过1厘米应劈成半圆或1/4。材料处理好之后应该立即投入固定液中，固定液的选择根据材料的性质及制片的目的而定。要尽快杀死并固定材料。能否迅速透入与固定液的渗透力、浓度、温度、以及材料的致密程度有关。固定液的用量一般为固定材料的总体积的20倍。水分少的材料可减少用量，含水多的材料应该换一次固定液，保证固定液维持一定的浓度，这样可在最短的时间渗透材料。(3)脱水：脱水的各级酒精用量约为材料体积的3-5倍，各级停留时间视材料性质、大小而定，一般为1-6小时。(4)透明：透明时在1:1酒精：二甲苯中加入少许番红干粉，使材料便于着色，包埋在石蜡中容易看见，切片时容易掌握材料方向。透明过程中如果液体变浑浊则表示脱水不干净，应再次进行脱水透明。(5)浸蜡：浸蜡是使石蜡慢慢溶于浸有材料的透明剂中，使石蜡完全代替透明剂进入材料组织中。为了避免石蜡与材料直接接触引起材料收缩，采用将石蜡溶化后在冷凝时搅拌使大量空气进入石蜡，然后切成小块藏于严密防尘的容器内，用时取适当数量浮于二甲苯上。浸蜡过程小心不要夹碎材料。(6)包埋：包埋的过程要尽可能迅速，利用碎冰助凝。如果石蜡凝固太慢会发生结晶，结晶的石蜡是不能切片的。冷凝后用解剖刀或刀片将材料周围的多余的蜡修去。(7)切片：切片不连续或蜡片卷曲蜡带不直等现象要注意及时纠正：1)切片刀口不锋利、蜡块与刀口平行角度不正确，是不能切成连续蜡带的主要原因。应注意刀口锋利度与蜡块的正确位置。2)蜡带上材料出现空洞是由于石蜡没有完全浸入材料应重新浸蜡。3)蜡带皱缩，是由于石蜡太软融点较低或切片时温度过高。所以夏天切片宜用融点较高的石蜡，另外，切片过薄低于5微米需要低温否则也容易皱缩。切片较厚在12微米以上，如果石蜡太硬则易碎裂。4)蜡带弯曲，是由于蜡块的上下两边修块不平行，而无法平展。5)蜡带出现裂纹或裂缝，是切片刀口某处有小口或切片刀已钝。应移动切片刀的位置。注意用毛笔刷去刀刃上的蜡屑。(8)粘片：蜡片切好后需要粘在载玻片上，这个步骤为粘片。在彻底清洗干净的载玻片是涂上一滴粘贴剂，用量绝对不能过多，用小指涂匀，再加几滴蒸馏水，用解剖针轻轻将蜡片放在液面上，将带有蜡片的载玻片放在展片台上。蜡片受热后慢慢伸展，完全申直后，用吸水纸吸去多余的水分，在展片台上烘干后，可在30度温箱中放置一昼夜，加速干燥。注意：1)蜡片背面比较平滑，而正面比较粗糙，因此应将背面和载玻片接触相粘贴，这样会比较牢固。2)载玻片应该保持清洁，否则在脱蜡时会发生材料脱落的现象。(9)染色制片：切片干燥后需要经过脱蜡，脱蜡就是将包埋材料外面及渗透到组织中的石蜡溶解掉。溶蜡剂常用二甲苯，步骤是将切片放于二甲苯5-10分钟，待溶去石蜡后再转入1:1二甲苯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甜菜叶石蜡包埋制片的方法，其特征在于，所述甜菜叶石蜡包埋制片的方法包括以下步骤：步骤一：将材料进行分割，置于广口瓶，固定处理24h；步骤二：脱水2h，透明1.5h；步骤三：采用番红、固绿对染；染色在纯酒精：纯二甲苯比例为1:1透明过程中加入染色剂，进行染色；步骤四：浸蜡用75℃恒温箱进行，分别标记为蜡杯Ⅰ，蜡杯Ⅱ，蜡杯Ⅲ；步骤五：采用半自动包埋机进行包埋，将材料放入包埋盒后摆好材料的位置，再将包埋盒放在碎冰机制成的冰块上，冷却；步骤六：将载玻片涂上一层粘片剂，滴一滴40℃左右的温水，将切好的蜡带用解剖针挑起放到上边，使切片展开，然后放到60℃烘箱或展片机上烘干，烘1h以上或更长时间；步骤七：湿封，先将加拿大树胶滴在组织的边缘位置，然后将盖玻片倾斜盖在胶液上，再将胶液压至组织上，自然风干。

【技术特征摘要】
1.一种甜菜叶石蜡包埋制片的方法，其特征在于，所述甜菜叶石蜡包埋制片的方法包括以下步骤：步骤一：将材料进行分割，置于广口瓶，固定处理24h；步骤二：脱水2h，透明1.5h；步骤三：采用番红、固绿对染；染色在纯酒精：纯二甲苯比例为1:1透明过程中加入染色剂，进行染色；步骤四：浸蜡用75℃恒温箱进行，分别标记为蜡杯Ⅰ，蜡杯Ⅱ，蜡杯Ⅲ；步骤五：采用半自动包埋机进行包埋，将材料放入包埋盒后摆好材料的位置，再将包埋盒放在碎冰机制成的冰块上，冷却；步骤六：将载玻片涂上一层粘片剂，滴一滴40℃左右的温水，将切好的蜡带用解剖针挑起放到上边，使切片展开，然后放到60℃烘箱或展片机上烘干，烘1h以上或更长时间；步骤七：湿封，先将加拿大树胶滴在组织的边缘位置，然后将盖玻片倾斜盖在胶液上，再将胶液压至组织上，自然风干。2.如权利要求1所述的甜菜叶石蜡包埋制片的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽萍，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23