本发明专利技术提供OsRBR2基因在创制水稻雄性不育系中的应用。采用CRISPR/Cas9编辑系统定点敲除OsRBR2基因，使该基因的功能完全丧失，获得了一种水稻雄性不育系。所述的OsRBR2基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术制备的水稻雄性不育系的营养生长完全正常，抽穗期无明显包穗，花药无花粉，异交结实率高。该水稻雄性不育系应用于杂交水稻育种，具有免除人工去雄、不用喷施植物外源激素、种子纯度高等优点，可极大提高生产效率、降低生产成本、减少环境污染，因而具有重要的应用前景。
Application of OsRBR2 Gene in Creating Rice Male Sterile Lines
The invention provides the application of OsRBR2 gene in the creation of rice male sterile line. OsRBR2 gene was knocked out by CRISPR/Cas9 editing system, and the function of OsRBR2 gene was completely lost. A rice male sterile line was obtained. The nucleotide sequence of the OsRBR2 gene is shown in the sequence table SEQ ID NO.1 and the amino acid sequence encoded in the sequence table SEQ ID NO.2. The rice male sterile line prepared by the invention has completely normal vegetative growth, no obvious ear wrapping at heading stage, no pollen in anthers and high outcrossing seed setting rate. The male sterile line of rice is used in hybrid rice breeding. It has the advantages of eliminating artificial male sterilization, not spraying exogenous plant hormones and high purity of seeds. It can greatly improve production efficiency, reduce production costs and reduce environmental pollution. Therefore, it has important application prospects.
【技术实现步骤摘要】
OsRBR2基因在创制水稻雄性不育系中的应用
本专利技术属于植物基因工程领域。具体的说，涉及OsRBR2基因在创制水稻雄性不育系中的应用，利用CRISPR/Cas9编辑方法定点敲除OsRBR2基因，创制水稻新型雄性不育系，应用杂交水稻生产。
技术介绍
水稻是全世界重要的粮食作物，全球约一半人口以水稻为主粮。因此，水稻对保障全球粮食安全具有重要的作用。杂交水稻生产技术是现代农业的一项重要成果，具有显著的增产效果。我国是世界上第一个推广杂交水稻的国家，为保障我国的粮食安全做出了重要贡献，也为维护世界粮食安全发挥了关键作用。我国杂交稻生产技术从“三系法”到“两系法”，一直处于国际领先水平。杂交稻生产模式的突破，得益于我国农业科学家对水稻雄性不育遗传材料的发现、研究和利用。雄性不育是指雌蕊发育正常，但雄性器官退化、发育不良或花粉、精子败育不能行使生育能力，是植物中普遍存在的现象。已有研究表明，花药中的绒毡层是接连接花粉母细胞，其细胞中富含线粒体、内质网、高尔基体等细胞器，代谢非常旺盛。它可向花药室中分泌大量碳水化合物、脂类等物质，为小孢子的发育提供所需的营养和构成花粉外壁的重要成分。此外，绒毡层还提供各种酶促进小孢子从四分体释放出来。绒毡层在花粉的发育过程中起着非常关键的作用，任何影响绒毡层发育的突变，都有可能导致花粉的败育。水稻雄性不育分为细胞质雄性不育和细胞核雄性不育。当前，我国大规模商业化应用的杂交稻以野败型和红莲型两种细胞质雄性不育为主，其细胞质来源比较单一，存在优良保持系创制效率较低、产量与品质潜力提升较慢等突出问题，而且遗传背景单一的农作物在生产上大面积推广，对生物与非生物胁迫的抵抗性变得十分脆弱，存在作物大面积感病、受灾的风险，从而影响粮食安全。这已在杂交玉米生产上得到验证。目前，我国杂交稻生产所面临的雄性不育系的遗传背景单一化趋势越来越明显，大部分三系杂交籼稻的不育系含有与野败型细胞质相同或相近的亲缘关系，一旦引起大规模病害爆发，必将严重威胁我国的粮食安全。因此，为了进一步大幅度提升杂交稻的产量与品质、避免因不育系的遗传基础单一而导致遗传脆弱性，亟需进一步加强杂交稻的种质资源开发和育种技术创新，挖掘可大规模商业化应用的新型雄性不育系，拓宽不育系的类型并建立相应的育种技术体系。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的上述不足，提供OsRBR2基因在创制水稻雄性不育系中的应用。本专利技术利用OsRBR2基因及其编码的蛋白质参与调控水稻花粉形成的特点，采用转基因技术，通过定点突变OsRBR2基因的核苷酸序列，造成其编码的蛋白序列发生突变而失去功能，获得了一种水稻雄性不育株系，在农业生产上具有十分重要的应用前景。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：本专利技术涉及一种利用OsRBR2基因创制雄性不育系，所述的OsRBR2基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示,所编码的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示；所述的不育株系的创制方法是：采用CRISPR/Cas9编辑方法敲除OsRBR2基因，使该基因在水稻种完全失去功能，进而获得水稻雄性不育株系。本专利技术所述的雄性不育株系的创制方法包括：选择常规水稻品种明恢86，采用CRISPR/Cas9编辑系统定点敲除OsRBR2基因，使得水稻中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列发生缺失、置换、插入等变异，进而引起SEQIDNO:2所述氨基酸序列发生改变，从而导致OsRBR2蛋白功能的丧失。本专利技术所述的利用CRISPR/Cas9编辑系统定点敲除OsRBR2基因创制水稻雄性不育株系的方法包括如下步骤：(a)合成单核苷酸序列引物，序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；SEQIDNO:3：5’-CAGGTTCCTCCGGCGTTAGGCTCSEQIDNO:4：5’-AACGAGCCTAACGCCGGAGGAAC(b)通过退火反应使（a）合成的单核苷酸序列形成二聚体结构并连接入载体，构建含有OsRBR2基因靶序列的OsRBR2-VK005-01质粒；(c)利用含OsRBR2-VK005-01质粒的根农杆菌浸染水稻品种；(d)利用如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的OsRBR2基因的特异性引物扩增基因组片段并测序，筛选出OsRBR2基因序列发生改变的突变体植株。SEQIDNO:5：5’-GTTCGGGAGCAAATCGGTGAGSEQIDNO:6：5’-CTTGAAGCAAGCCGCTGTGA本专利技术还涉及一种水稻雄性不育株系创制方法获得的水稻雄性不育株系在水稻生产中的应用：以所述水稻雄性不育株系作为母本，进行杂交育种。与现有技术相比，本专利技术具有明显优势：本专利技术制备的水稻雄性不育系的营养生长完全正常，与其原有亲本在主要农艺性状方面无明显差异，抽穗期无明显包穗，但其花药发育明显异常、花粉败育彻底而无花粉，为完全不育株。本专利技术所创制的水稻雄性不育的种质应用于杂交水稻育种，具有免除人工去雄、不用喷施植物外源激素、异交结实率高、种子纯度高等优点，可极大提高生产效率、降低生产成本、减少环境污染，因而具有重要的应用前景。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点会变得更明显：图1：CRISPR/Cas9编辑系统所用的载体VK005-01图。图2：野生型与CRISPR/Cas9敲除OsRBR2基因的突变体表型图；A：野生型与突变体植株的表型；B：野生型小穗（去除内、外稃片）；C：突变体小穗（去除内、外稃片）；D：野生型成熟的花药与花粉（I2/KI染色）；E：突变体成熟的花药中无花粉（I2/KI染色）；F：野生型成熟的花粉（I2/KI染色）；G：突变体无花粉（I2/KI染色）；H：成熟期野生型穗的高结实与突变体无结的表型。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术进行具体、详细说明，以有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术。实施例1：水稻雄性不育株系的创制根据CRISPR/Cas9编辑系统定点敲除的原理，确定基因定点编辑的靶位点，设计如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物。通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构并连接入如图1所示的载体VK005-01（购自北京唯尚立德生物科技有限公司，货号：20160601S），构建含有OsRBR2基因靶序列的质粒OsRBR2-VK005-01。将该质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，挑取阳性单克隆，摇菌后提质粒，进行测序确认。将构建好的OsRBR2-VK005-01质粒转入到根农杆菌EHA105中，用于水稻遗传转化。SEQIDNO:3：5’-CAGGTTCCTCCGGCGTTAGGCTCSEQIDNO:4：5’-AACGAGCCTAACGCCGGAGGAAC利用传统的农杆菌侵染愈伤法技术，将OsRBR2-VK005-01质粒转入根农杆菌EHA105中，浸染水稻籼稻品种明恢86的愈伤组织。挑选生长迅速、颜色鲜黄、表面光滑、质地致密、直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒作转化的受体。用含有双元质粒载体的农杆菌EHA105菌株浸染水稻愈伤，置25℃条件下暗培养3天；经浓度为30mg/L潮霉素的筛选培养基（NB培养基+2mg/L2,4-D+250mg/L羧苄青霉素，pH5.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.OsRBR2基因在创制水稻雄性不育系中的应用。
【技术特征摘要】
1.OsRBR2基因在创制水稻雄性不育系中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OsRBR2基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的水稻雄性不育株系的创制方法，是采用CRISPR/Cas9编辑方法定点敲除OsRBR2基因，使该基因在水稻中完全失去功能，进而获得水稻雄性不育株系。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述CRISPR/Cas9编辑方法具体包括：选择常规水稻品种，采用CRISPR/Cas9编辑系统定点敲除OsRBR2基因，使得水稻中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列发生缺失、置换、插入等变异，进而使得SEQIDNO:2所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：段远霖，吴为人，潘美珍，蔡正正，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35
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