一种特异性结合牛血清白蛋白核酸适配体的筛选方法本发明专利技术涉及化学分析技术领域。本发明专利技术中基于SELEX技术和琼脂糖凝胶电泳相结合的牛血清白蛋白核酸适配体筛选技术与传统筛选技术相比，具有操作简便、筛选过程成本低、筛选周期更短的优势。本发明专利技术筛选出的核酸适配体稳定性强、合成方便且易于标记各种报告分子，可长期保存使用。本发明专利技术中得到的核酸适配体，能与牛血清白蛋白特异性结合，且亲和力高，是目前为止第一个成功筛选的有关牛血清白蛋白核酸适配体的序列。本发明专利技术中利用该核酸适配体修饰不同的报告分子，可以构建各种生物传感器，用于食品和药品等多方面的分析检测。
A Screening Method for Specifically Binding Bovine Serum Albumin Nucleic Acid Adapters
The invention relates to a screening method for a specific binding bovine serum albumin nucleic acid aptamer, which relates to the field of chemical analysis technology. Compared with traditional screening technology, bovine serum albumin aptamer screening technology based on SELEX technology and agarose gel electrophoresis has advantages of simple operation, low cost of screening process and shorter screening cycle. The nucleic acid aptamer screened by the invention has strong stability, convenient synthesis and easy labeling of various reporter molecules, and can be used for long-term preservation. The nucleic acid adapter obtained in the present invention can specifically bind to bovine serum albumin and has high affinity. It is the first successful sequence of bovine serum albumin nucleic acid adapter screened so far. In the present invention, different reporter molecules are modified by the nucleic acid adapter, and various biosensors can be constructed for analysis and detection of food, medicine and other aspects.
【技术实现步骤摘要】
一种特异性结合牛血清白蛋白核酸适配体的筛选方法
本专利技术涉及化学分析
，具体地说是一种特异性结合牛血清白蛋白核酸适配体的筛选方法。
技术介绍
核酸适配体(又称适配体，aptamer)是通过指数富集的配体系统进化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,SELEX)技术筛选得到的能够与靶分子特异性结合的一小段ssDNA或RNA。适体具有靶分子广泛、亲和力强、易修饰等优点，在分子化学、食品安全、临床诊断与治疗等方面应用广泛。SELEX是利用组合化学的原理，在体外构建一个人工合成的随机寡核苷酸文库，经过文库中序列与靶标的特异性结合，筛选目标核酸适配体的一种新技术。由于随机文库中含有大量一级结构不同的单链寡核苷酸片段，他们在溶液中与靶分子相遇时，可以形成不同的空间结构，由于其空间结构的多样性，可供靶分子通过构象匹配的方式筛选出能与其具有高亲和力和特异性的核酸序列。牛血清白蛋白是牛血清中的一种球蛋白，又称第五组分。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生物和机械保护作用和载体作用。牛血清白蛋白分子量为66.446kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白多用在生化研究、遗传工程和医药研究、医药保健食品等。由于人血清白蛋白的医用价值很高，市面上的货源很紧张，用人血清白蛋白做实验的价值很高，而牛血清白蛋白的氨基酸序列与人血清白蛋白的相似性很高，可以用牛血清白蛋白作为前期实验的替代品。目前科研中还尚未有牛血清白蛋白核酸适配体的筛选报道，且传统SELEX筛选过程耗时耗力,经多轮筛选才能得到特异性较强的适配体。本实验建立了基于SELEX技术和琼脂糖凝胶电泳相结合的牛血清白蛋白核酸适配体筛选方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种特异性结合牛血清白蛋白核酸适配体的筛选方法。上述目的通过以下技术方案实现：1.合成以下序列所示的原始随机ssDNA文库和引物：原始随机ssDNA文库：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；上引物：5’-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’；下引物：5’–biotin-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’。2建立基于琼脂糖凝胶电泳的牛血清白蛋白核酸适配体筛选方法筛选全过程所用的：结合缓冲液的组成为20mMTris-HCL，1MNaCl，1mMEDTA，pH7.8。所述的基于琼脂糖凝胶电泳的牛血清白蛋白核酸适配体筛选方法步骤：2.1第一轮筛选2.1.1单链随机文库制备1-2OD原始随机ssDNA文库于95℃水浴5min，随后置于冰上冷却至室温后使用。2.1.2牛血清白蛋白(BSA)溶液准备用双蒸水配制500ng/mlBSA溶液备用。2.1.3制备琼脂糖凝胶及固载BSA蛋白配置2％的琼脂糖凝胶溶液(即每100mlTAE缓冲液含有2g琼脂糖)，在微波炉中加热2％琼脂糖溶液1-2min，95-98℃，此时立刻将提前制好的500ng/mL的BSA溶液加入到未冷却形成凝胶的琼脂糖溶液中,琼脂糖溶液用量和加入的BSA溶液体积比为3：2，充分混匀后转入制胶板室温静置30min以上冷却形成琼脂糖凝胶。2.1.4琼脂糖凝胶电泳将步骤2.1.3固载BSA蛋白的琼脂糖凝胶放入电泳槽中,分别加入3-5μlDNAmarker作为指示和50-300nmol的原始随机单链文库后开始电泳,原始随机单链文库的用量和凝胶中固定的BSA溶液体积比为1:1200，电压150-200V,电泳时间25-35min。2.1.5切胶回收电泳结束后通过多功能凝胶成像仪在300-600bp处进行切胶回收条带，按照DNA切胶回收试剂盒提供的说明书提取凝胶中的DNA作为下一步PCR扩增的模板。2.1.6以2.1.5所得DNA为模板，下游引物和上游引物进行PCR扩增。2.2第二轮筛选2.2.1制备单链DNA：取链霉亲和素磁珠用结合缓冲液洗三遍(链霉亲和素磁珠和结合缓冲液用量体积比为1:2)，加入到2.1.6PCR扩增的产物中，振动摇匀捕获30-60min，磁分离去上清，用结合缓冲液洗三遍(链霉亲和素磁珠和结合缓冲液用量体积比为1:2)，加入0.2mol/L的氢氧化钠溶液反应5min(链霉亲和素磁珠和氢氧化钠溶液用量体积比为8:5)，磁分离取上清，后加入的盐酸用广泛pH试纸调至7，纯化、冻干。该次级ssDNA文库用作下一轮筛选。2.2.2单链随机文库准备步骤2.2.1获得的次级ssDNA文库于95℃水浴5min，随后置于冰上冷却至室温后使用。2.2.3牛血清白蛋白(BSA)溶液准备用双蒸水配制500ng/mlBSA溶液备用。2.2.4制备琼脂糖凝胶及固载BSA蛋白操作步骤同步骤2.1.32.2.5琼脂糖凝胶电泳将步骤2.2.4固载BSA蛋白的琼脂糖凝胶放入电泳槽中,分别加入3-5μlDNAmarker作为指示和步骤2.2.2准备的次级文库后开始电泳,次级文库的用量和凝胶中固定的BSA溶液体积比为1:1200电压150-200V,电泳时间25-35min。2.2.6切胶回收电泳结束后通过多功能凝胶成像仪在300-600bp处进行切胶回收条带，按照DNA切胶回收试剂盒提供的说明书提取凝胶中的DNA作为下一步PCR扩增的模板。2.2.7以2.2.6所得DNA为模板，下游引物和上游引物进行PCR扩增。2.3根据步骤2.2循环5-8次，富集能与牛血清白蛋白特异性结合的核酸适配体。3.获得牛血清白蛋白核酸适配体：每轮筛选所得到的次级ssDNA文库通过5’端标记荧光基团与靶标结合后，用酶标仪测次级ssDNA文库与靶标结合能力。直到荧光强度达到最大饱和状态，此时得到牛血清白蛋白核酸适配体，如图3。4.克隆测序：将最后一轮筛选的得到的核酸适配体送到上海生工技术有限公司进行克隆测序，即得到上述筛选所得的核酸适配体序列,即5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGGTATCGAGCGCAGGGGCGCCTTTGTTAATGATTACGGGCGCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。5.亲和力分析：用结合缓冲液将核酸适配体配制成一系列浓度。每个浓度梯度核酸适配体，经过90℃水浴10min，4℃15min，室温5min活化，将其加入牛血清白蛋白-磁珠复合物中，37℃孵育30-60min，核酸适配体用量和牛血清白蛋白-磁珠复合物用量体积比为1：5。磁分离收集未结合到牛血清白蛋白-磁珠复合物上的上清液，用超微量紫外分光光度计测未结合的核酸适配体浓度，并计算出与蛋白复合物结合的核酸适配体浓度。以核酸适配体浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制结合饱和曲线，求得Kd值为69.44。如图2所示，说明核酸适配体与牛血清白蛋白的结合能力非常强。本专利技术优点：(1)本专利技术中基于SELEX技术和琼脂糖凝胶电泳相结合的牛血清白蛋白核酸适配体筛选技术与传统筛选技术相比，具有操作简便、筛选过程成本低、筛选周期更短的优势。(2)本专利技术筛选出的核酸适配体稳定性强、合成方便且易于标记各种报告分子，可长期保存使用。(3)本专利技术中得到的核酸适配体，能与牛本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性结合牛血清白蛋白核酸适配体的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：1).合成以下序列所示的原始随机ssDNA文库和引物：原始随机ssDNA文库：5’‑AGCAGCACAGAGGTCAGATG‑N40‑CCTATGCGTGCTACCGTGAA‑3’；上引物：5’‑FAM‑AGCAGCACAGAGGTCAGATG‑3’；下引物：5’–biotin‑TTCACGGTAGCACGCATAGG‑3’；2)建立基于琼脂糖凝胶电泳的牛血清白蛋白核酸适配体筛选方法筛选全过程所用的结合缓冲液的组成为20mM Tris‑HCL，1M NaCl，1mM EDTA，pH 7.8；所述的基于琼脂糖凝胶电泳的牛血清白蛋白核酸适配体筛选方法步骤：2.1第一轮筛选2.1.1单链随机文库制备1‑2OD原始随机ssDNA文库于95℃水浴5min，随后置于冰上冷却至室温后使用；2.1.2牛血清白蛋白BSA溶液准备用双蒸水配制500ng/ml BSA溶液备用；2.1.3制备琼脂糖凝胶及固载BSA蛋白配置2％的琼脂糖凝胶溶液即每100mlTAE缓冲液含有2g琼脂糖，在微波炉中加热2％琼脂糖溶液1‑2min，95‑98℃，此时立刻将提前制好的500ng/mL的BSA溶液加入到未冷却形成凝胶的琼脂糖溶液中,琼脂糖溶液和加入的BSA溶液体积比为3：2，充分混匀后转入制胶板室温静置30min以上冷却形成琼脂糖凝胶；2.1.4琼脂糖凝胶电泳将步骤2.1.3固载BSA蛋白的琼脂糖凝胶放入电泳槽中,分别加入3‑5μl DNA marker作为指示和50‑300nmol的原始随机单链文库后开始电泳,原始随机单链文库的用量和凝胶中固定的BSA溶液体积比为1:1200，电压150‑200V,电泳时间25‑35min；2.1.5切胶回收电泳结束后通过多功能凝胶成像仪在300‑600bp处进行切胶回收条带，按照DNA切胶回收试剂盒提供的说明书提取凝胶中的DNA作为下一步PCR扩增的模板；2.1.6以2.1.5所得DNA为模板，下游引物和上游引物进行PCR扩增；2.2第二轮筛选2.2.1制备单链DNA：取链霉亲和素磁珠用结合缓冲液洗三遍，加入到2.1.6PCR扩增的产物中，振动摇匀捕获30‑60min，磁分离去上清，用结合缓冲液洗三遍，加入0.2mol/L的氢氧化钠溶液反应5min；链霉亲和素磁珠和氢氧化钠溶液用量体积比为8:5；磁分离取上清，后加入的盐酸用广泛pH试纸调至7，纯化、冻干得到次级ssDNA文库用作下一轮筛选；2.2.2单链随机文库准备步骤2.2.1获得的次级ssDNA文库于95℃水浴5min，随后置于冰上冷却至室温后使用；2.2.3牛血清白蛋白BSA溶液准备用双蒸水配制500ng/ml BSA溶液备用；2.2.4制备琼脂糖凝胶及固载BSA蛋白操作步骤同步骤2.1.32.2.5琼脂糖凝胶电泳将步骤2.2.4固载BSA蛋白的琼脂糖凝胶放入电泳槽中,分别加入3‑5μl DNA marker作为指示和步骤2.2.2准备的次级文库后开始电泳,次级文库的用量和凝胶中固定的BSA溶液体积比为1:1200，电压150‑200V,电泳时间25‑35min；2.2.6切胶回收电泳结束后通过多功能凝胶成像仪在300‑600bp处进行切胶回收条带，按照DNA切胶回收试剂盒提供的说明书提取凝胶中的DNA作为下一步PCR扩增的模板；2.2.7以2.2.6所得DNA为模板，下游引物和上游引物进行PCR扩增；2.3按照步骤2.2循环5‑8次，富集能与牛血清白蛋白特异性结合的核酸适配体；3).获得牛血清白蛋白核酸适配体：每轮筛选所得到的次级ssDNA文库通过5’端标记荧光基团与靶标结合后，用酶标仪测次级ssDNA文库与靶标结合能力；直到荧光强度达到最大饱和状态，此时得到牛血清白蛋白核酸适配体。...
【技术特征摘要】
1.一种特异性结合牛血清白蛋白核酸适配体的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：1).合成以下序列所示的原始随机ssDNA文库和引物：原始随机ssDNA文库：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；上引物：5’-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’；下引物：5’–biotin-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’；2)建立基于琼脂糖凝胶电泳的牛血清白蛋白核酸适配体筛选方法筛选全过程所用的结合缓冲液的组成为20mMTris-HCL，1MNaCl，1mMEDTA，pH7.8；所述的基于琼脂糖凝胶电泳的牛血清白蛋白核酸适配体筛选方法步骤：2.1第一轮筛选2.1.1单链随机文库制备1-2OD原始随机ssDNA文库于95℃水浴5min，随后置于冰上冷却至室温后使用；2.1.2牛血清白蛋白BSA溶液准备用双蒸水配制500ng/mlBSA溶液备用；2.1.3制备琼脂糖凝胶及固载BSA蛋白配置2％的琼脂糖凝胶溶液即每100mlTAE缓冲液含有2g琼脂糖，在微波炉中加热2％琼脂糖溶液1-2min，95-98℃，此时立刻将提前制好的500ng/mL的BSA溶液加入到未冷却形成凝胶的琼脂糖溶液中,琼脂糖溶液和加入的BSA溶液体积比为3：2，充分混匀后转入制胶板室温静置30min以上冷却形成琼脂糖凝胶；2.1.4琼脂糖凝胶电泳将步骤2.1.3固载BSA蛋白的琼脂糖凝胶放入电泳槽中,分别加入3-5μlDNAmarker作为指示和50-300nmol的原始随机单链文库后开始电泳,原始随机单链文库的用量和凝胶中固定的BSA溶液体积比为1:1200，电压150-200V,电泳时间25-35min；2.1.5切胶回收电泳结束后通过多功能凝胶成像仪在300-600bp处进行切胶回收条带，按照DNA切胶回收试剂盒提供的说明书提取凝胶中的DNA作为下一步PCR扩增的模板；2.1.6以2.1.5所得DNA为模板，下游引物和上游引物进行PCR扩增；2.2第二轮筛选2.2.1制备单链DNA...
【专利技术属性】
技术研发人员：李灏，王楚楚，杜晓彦，谢甜甜，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。