本发明专利技术涉及一种原代干细胞分离液以及采用该原代干细胞分离液从脐带中分离原代间充质干细胞的方法；本发明专利技术的原代干细胞分离液采用DMEM基础培养基作为溶液以及添加特定浓度的胶原酶I型、分散酶II型和脱氧核糖核酸酶的组合，能够快速便捷地从脐带组织中收获大量且健康的原代间充质干细胞，大大提高了间充质干细胞培养的可控性和细胞收获率，不论是对于科研实验的条件控制或是临床应用的安全性都具有很大的意义。
A Primary Stem Cell Separation Solution and a Method for Isolating Primary Mesenchymal Stem Cells
The invention relates to a primary stem cell separation solution and a method for separating primary mesenchymal stem cells from umbilical cord using the primary stem cell separation solution; the original stem cell separation solution of the invention adopts DMEM basic culture medium as solution and adds a combination of collagenase type I, dispersase type II and deoxyribonuclease of a specific concentration, which can be quickly and conveniently harvested from umbilical cord tissue. A large number of healthy primary mesenchymal stem cells have greatly improved the controllability of mesenchymal stem cell culture and cell harvesting rate. It is of great significance to control the conditions of scientific research and experiment and to ensure the safety of clinical application.
【技术实现步骤摘要】
一种原代干细胞分离液以及分离原代间充质干细胞的方法
本专利技术涉及一种原代干细胞分离液及其制备方法，以及从脐带组织中分离原代间充质干细胞的方法，属于干细胞
技术介绍
间充质干细胞(MSCs，mesenchymalstemcells)，最早在骨髓中被发现，是一种来源于中胚层的多能干细胞，具有自我更新能力、多向分化潜能、造血支持、免疫调控、可连续培养等特点，现已受到越来越多的关注。间充质干细胞在体内或体外一定条件下可以向多种细胞组织类型分化。它不仅可以向多种间质来源的细胞谱系分化，也可以向其他的细胞谱系分化。由于体外分离培养的MSCs在细胞表型上没有明显的改变，也无功能缺失，因此被认为是理想的修复和抗衰老细胞来源。目前已知间充质干细胞可从骨髓、脂肪组织、华顿氏胶质、脐带、软骨组织和齿龈分离出來，其中自脐带可以获得更多的干细胞，且脐带取得容易，无需侵入性的医疗程序。并且，自脐带分离的干细胞，表面所携抗原少且具有抑制免疫反应的特性，对于克服异体排斥反应，有更显著的效果，因此极具推广应用的价值。常见的原代细胞分离方式是组织块法，这个分法虽然简单，但人工操作的时间很长，之后原代细胞生长也不平均，因此也有人使用酶消化法。可是该如何选择消化酶的组合，以什么样的剂量操作、又以什么样的条件反应才能取得比组织块法更多的细胞量，本领域一直没有清楚地了解过。因此，本领域希望能够开发出适合原代干细胞分离的分离液，特别是从脐带中分离间充质干细胞的分离液。
技术实现思路
鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本专利技术一方面提供了一种原代干细胞分离液，其中，所述原代干细胞分离液为含有添加组分的基础培养基，所述基础培养基为DMEM培养基；所述添加组分及其浓度如下：胶原酶I型225-250U/ml；分散酶II型0.4～0.6U/ml；脱氧核糖核酸酶5-10U/ml；所述胶原酶I型和所述分散酶II型均是以细菌为载体的重组表达产品；所述脱氧核糖核酸酶是以酵母菌为载体的重组表达产品。优选的，所述添加组分及其浓度如下：胶原酶I型240U/ml；分散酶II型0.5U/ml；脱氧核糖核酸酶8U/ml。本专利技术另一方面提供了一种从脐带组织分离原代间充质干细胞的方法，其中，该方法包括以下步骤：步骤1)，将获得的脐带组织剪成2-5mm3的大小的脐带组织块；步骤2)，将所述脐带组织块浸润到权利要求1或2所述的原代干细胞分离液中，在37摄氏度的温度环境下反应至少10小时；步骤3)，待步骤2)反应完成，向其中加入0.05％EDTA溶液终止反应，所述EDTA溶液的体积与所述原代干细胞分离液的体积相同；步骤4)，将步骤3)获得的混合液放入离心机中，以1500xg(离心力)离心5-10分钟，去除上清液，取离心沉淀；步骤5)，将步骤4)获得的离心沉淀重悬于DPBS缓冲液中，再放入离心机中，以250xg(离心力)离心5-10分钟，去除上清液，获得的离心沉淀即为从脐带组织中分离的原代间充质干细胞；其中，所述DPBS缓冲液为不含钙镁离子的DPBS缓冲液。优选的，所述步骤5)中，所述重悬于DPBS缓冲液之后再离心的操作过程重复1-2次，最后获得的离心沉淀即为从脐带组织中分离的原代间充质干细胞。本专利技术的原代干细胞分离液，采用DMEM基础培养基作为溶液以及添加特定浓度的胶原酶I型、分散酶II型和脱氧核糖核酸酶的组合，能够快速便捷地从脐带组织中收获大量且健康的原代间充质干细胞，大大提高了间充质干细胞培养的可控性和细胞收获率，不论是对于科研实验的条件控制或是临床应用的安全性都具有很大的意义。附图说明图1为分离获得的原代间充质干细胞经培养后的细胞数目随时间变化的曲线图；图2为培养第10天的原代间充质干细胞在光学显微镜下的照片；图3为培养第19天的第3代间充质干细胞在光学显微镜下的照片；图4为第4代间充质干细胞经过成骨诱导分化培养后的染色结果；图5为第4代间充质干细胞经过成软骨诱导分化培养后的染色结果；图6为第4代间充质干细胞经过成脂肪细胞诱导分化培养后的染色结果。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术作进一步的说明，但本专利技术并不限于这些具体实施方式。在本专利技术的一个具体实施方案中，一种原代干细胞分离液，其中，所述原代干细胞分离液为含有添加组分的基础培养基，所述基础培养基为DMEM培养基；所述添加组分及其浓度如下：胶原酶I型225-250U/ml；分散酶II型0.4～0.6U/ml；脱氧核糖核酸酶5-10U/ml；所述胶原酶I型和所述分散酶II型均是以细菌为载体的重组表达产品；所述脱氧核糖核酸酶是以酵母菌为载体的重组表达产品。本专利技术的专利技术人经过大量的研究试验发现，当原代干细胞分离液采用DMEM基础培养基作为溶液以及添加特定浓度的胶原酶I型、分散酶II型和脱氧核糖核酸酶的组合，能够快速便捷地从脐带组织中收获大量且健康的原代间充质干细胞，大大提高了间充质干细胞培养的可控性和细胞收获率，不论是对于科研实验的条件控制或是临床应用的安全性都具有很大的意义。实施例1实施例1的原代干细胞分离液的配制过程如下：以配制20ml原代干细胞分离液为例；分别称取胶原酶I型、分散酶II型和脱氧核糖核酸酶；其中，胶原酶I型购自生工生物，货号A004194，其为以Clostridiumhistolyticum细菌为载体的重组表达产品；其中，分散酶II型购自罗氏，货号4942078001，其为以Bacilluspolymyxa细菌为载体的重组表达产品；其中，脱氧核糖核酸酶购自罗氏，货号4536282001，其为以Pichiapastoris酵母菌为载体的重组表达产品。称取胶原酶I型20mg(相当于4800U的胶原酶I型)，称取分散酶II型10mg(相当于10U的分散酶II型)，称取脱氧核糖核酸酶16mg(相当于160U的脱氧核糖核酸酶)；将三种酶溶解于DMEM培养基(购自BI公司，货号01-051-1ACS)中，采用DMEM培养基定容至20ml的体积，再以0.2um滤芯(购自赛多利斯公司，货号17597K)过滤除菌后使用。获得的原代干细胞分离液中，胶原酶I型的浓度为240U/ml，分散酶II型的浓度为0.5U/ml，脱氧核糖核酸酶的浓度为8U/ml。应用例1采用实施例1配制获得的原代干细胞分离液，从脐带组织中分离原代间充质干细胞，具体步骤如下：步骤1)，获取脐带组织；若脐带组织未清洗处理，可采用PBS溶液洗净脐带组织上的沾附的血液，并将脐带组织中的3条血管去除；然后用无菌手术剪刀将清洁处理后的脐带组织剪成3mm3左右大小的脐带组织块；步骤2)，将步骤1)获得的脐带组织块放入50ml的离心管中，再加入原代干细胞分离液使脐带组织块完全浸润(一般来说，一根脐带处理后获得的脐带组织块至少需要10-20ml左右的原代干细胞分离液)；然后，将离心管平放在37摄氏度的培养箱中，在37摄氏度的温度环境下反应至少10个小时，步骤3)，待步骤2)反应完成，向其中加入0.05％EDTA溶液(购自BI公司，产品货号为03-015-1B)终止反应，EDTA溶液的体积与原代干细胞分离液的体积相同；步骤4)，步骤3)获得的混合液较为粘稠，将其放入离心机中，以1500xg(离心力)离心5分钟，去除上清液(即去除上述的原代干细胞分离液和大部分的ED本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种原代干细胞分离液，其特征在于：所述原代干细胞分离液为含有添加组分的基础培养基，所述基础培养基为DMEM培养基；所述添加组分及其浓度如下：胶原酶I型225‑250U/ml；分散酶II型0.4～0.6U/ml；脱氧核糖核酸酶5‑10U/ml；所述胶原酶I型和所述分散酶II型均是以细菌为载体的重组表达产品；所述脱氧核糖核酸酶是以酵母菌为载体的重组表达产品。
【技术特征摘要】
1.一种原代干细胞分离液，其特征在于：所述原代干细胞分离液为含有添加组分的基础培养基，所述基础培养基为DMEM培养基；所述添加组分及其浓度如下：胶原酶I型225-250U/ml；分散酶II型0.4～0.6U/ml；脱氧核糖核酸酶5-10U/ml；所述胶原酶I型和所述分散酶II型均是以细菌为载体的重组表达产品；所述脱氧核糖核酸酶是以酵母菌为载体的重组表达产品。2.如权利要求1所述的原代干细胞分离液，其特征在于：所述添加组分及其浓度如下：胶原酶I型240U/ml；分散酶II型0.5U/ml；脱氧核糖核酸酶8U/ml。3.一种从脐带组织分离原代间充质干细胞的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：步骤1)，将获得的脐带组织剪成2-5mm3的大小的脐带组织块；步骤2)，将所述脐带组织块浸润到权利要求1或2所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛宜青，颜学恒，
申请(专利权)人：上海逍鹏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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