一种酸性多糖中单糖组成的测定方法技术

本发明专利技术提供了一种测定酸性多糖中单糖组成的方法，检测方法步骤包括：(1)通过弱酸对多糖进行第一步水解，之后配合强酸进行第二步水解；(2)通过离子色谱结合电化学检测器测定水解样品中的单糖组成。所述第一步水解中的弱酸为摩尔浓度较低的三氟乙酸，第二步水解中的强酸为摩尔浓度较高的硫酸。根据所获得的离子色谱图谱，基于峰迁移时间和峰面积可得到单糖的种类和含量。与传统的一步水解法相比，本方法精确度高，选择性好，适用于酸性多糖的单糖组成分析。

【技术实现步骤摘要】
一种酸性多糖中单糖组成的测定方法
本专利技术涉及天然产物来源多糖种的单糖组成分析，具体涉及一种天然产物来源酸性多糖中单糖组成分析。
技术介绍
多糖是指由超过10个的单糖以糖苷键连接而成的高分子聚合物，通常存在于动物细胞、高等植物细胞及部分微生物细胞壁中，是生命体的重要组成部分，也是维持机体生命活动必不可少的化合物。多糖生物活性与其结构关系密切，而其单糖组成是结构基础。在多糖的单糖组成分析过程中，涉及水解单糖、分离及检测等过程，其中将多糖水解成游离的单糖是非常重要的一个步骤，目前常用的方法有酸水解、碱水解、酶催化降解及物理降解等。碱催化降解反应只能从多糖链的还原末端逐个脱落出单糖，反应速率较慢，并且在水解过程中时常伴随着产物结构的变化，因此目前碱水解技术尚无法满足将多糖水解为单糖的需要。酶催化降解可以选择性地水解不同的糖苷键，并且反应速率快，但是酶的高度专一性导致在实际应用中很难找到与底物相契合的酶，酶催化降解对温度、pH等环境有较多要求，因此酶催化降解在多糖水解为单糖的实际应用中有诸多限制。物理降解技术包括有微波、辐射、超声波等，但这些物理手段通常很难使多糖完全降解为单糖，通常作为一种辅助手段。酸水解是指溶液中的氢离子使糖苷键上的氧原子质子化从而导致糖苷键断裂的过程，酸水解反应可以发生在多糖链的任一糖苷键中，具有反应速率快、水解产物结构变化小等优点，是多糖水解为单糖的主流技术。酸水解常用的酸有盐酸、硫酸、三氟乙酸等，在多糖被水解成为单糖过程中，往往会伴随部分单糖的损失，尤其是中性糖和氨基糖，导致无法准确测定多糖中的单糖组成，对于酸性多糖中，由于糖醛酸难以被水解，要在尽量减少中性糖的损失的情况下，水解出更多的糖醛酸，从而准确测定出酸性多糖中单糖组成。目前，针对酸性多糖的单糖组成测定，常用的方法有单种类酸水解，也有人采用综合的方法优化水解效果，如孙元琳等报道一种当归果胶多糖中的糖醛酸含量测定方法(中国食品学报,2008,8:128-132)，认为多糖需经脱脂处理并结合弱酸水解和酶解才能得到准确、真实的结果，DeRuiter等(Analyticalbiochemistry,1992,207(1):176-185)发现甲醇解结合三氟乙酸对含糖醛酸类多糖的水解效果较好。但是，孙元琳等人报道的方法需要对多糖进行脱脂特殊处理，同时要选择特异性酶的方法处理，步骤较为繁琐且成本较高；而DeRuiter等所推荐的方法，需要将甲醇溶解在盐酸中，处理工艺特殊、复杂。因此，需要对富含糖醛酸多糖水解进行进一步优化。
技术实现思路
专利技术目的：为克服传统水解方法的不足，本专利技术提供了一种新的一种酸性多糖单糖中组成的测定方法，尤其是提高多糖中单糖水解效率。本专利技术具体技术方案如下：一种酸性多糖单糖中组成的测定方法，包括以下步骤：(1)多糖水解：称取5mg多糖，加入3mL三氟乙酸溶液加热进行第一步水解，反应结束后再冷却，之后加入3mL摩尔体积浓度(mol/L)为2的硫酸进行第二步水解，于100℃水解时间2h，水解完成后将样品溶液转移至250mL容量瓶定容，取稀释后的水解样品溶液并用0.22μm水系微孔滤膜过滤，取滤液用离子色谱仪分析。(2)检测条件：所述离子色谱仪为DIONEXICS-5000，柱子采用DIONEX公司的CarboPacTMPA20分析柱(3mm×150mm)，柱温箱温度为30.0℃；检测系统为电化学检测器(25.0℃)，流动相由摩尔体积浓度(mol/L)为0.25的氢氧化钠溶液、摩尔体积浓度(mol/L)为1的醋酸钠溶液和超纯水组成，梯度洗脱。所述酸性多糖包括糖醛酸含量较高的胡萝卜多糖、秋葵多糖和茶多糖等植物来源多糖。所述三氟乙酸摩尔体积浓度(mol/L)为0.01-0.3，优选为0.03-0.06。所述第一步水解中水解温度为40-120℃，优选为70-90℃。所述第一步水解中水解时间为0.25-2.5h，优选为0.45-1.25h。所述单糖检测方法如下：1.仪器与试剂1.1仪器DionexICS5000型离子色谱仪美国Dionex公司；Milli-Q超纯水仪美国Millipore公司；高速冷冻离心机美国Thermo公司，等。1.2试剂单糖标准品(L-岩藻糖fuc、鼠李糖rha、D-阿拉伯糖ara、D-半乳糖gal、D-葡萄糖glu、D-木糖xyl、D-甘露糖man、D-果糖fru、半乳糖醛酸gala、葡萄糖醛酸glua)、醋酸钠美国Sigma公司；三氟乙酸上海阿拉丁生化试剂公司；无水乙醇、浓硫酸等均为国产分析纯。2.色谱条件色谱柱：CarboPacTMPA20分析柱(3mm×150mm)；柱温：30.0℃；流速：0.5mL/min；检测器：电化学检测器，温度为25.0℃；流动相：A为摩尔体积浓度(mol/L)为0.25的氢氧化钠溶液，B为摩尔体积浓度(mol/L)为1醋酸钠溶液，C为超纯水，梯度洗脱。3.标准溶液制备准确称取十种单糖标准品各5mg于同一容量瓶中，定容，摇匀，配制成质量体积浓度(mg/mL)为0.1的混合标准品溶液，然后稀释成梯度浓度，过0.22μm水系滤膜后进离子色谱仪分析。4.结果分析将稀释成系列浓度的混合标准品溶液过膜后进离子色谱仪分析，以单糖标准品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作线性标准曲线。得到如表1的线性回归方程。表1单糖标准品回归方程表由表1及图1可知，单糖标准品线性良好，单糖之间能有效分离，此检测方法可行，可对本实验的单糖含量进行检测。与现有技术相比，本专利技术具有以下效果：本专利技术方法可以让酸性多糖得到较完全的水解，能更准确的对酸性多糖中的单糖进行定性及定量分析，且操作简便快捷，灵敏度高。相比较于传统的硫酸水解法，新的两步水解法测出的总糖含量明显提高，取得了较好的效果。附图说明图1为单糖标准品与胡萝卜多糖水解样品色谱重叠图；图2为单糖标准品与茶多糖水解样品色谱重叠图；图3为单糖标准品与秋葵多糖水解样品色谱重叠图；图4为TFA浓度对单糖总量的影响曲线；图5为水解温度对单糖总量的影响曲线；图6为水解时间对单糖总量的影响曲线。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。为能准确测定多糖中单糖组成，本专利技术采用两步水解法对多糖进行水解，并以胡萝卜多糖为模型，通过单因素试验对TFA水解条件进行进一步优化。实施例1两步水解法分析酸性多糖中单糖组成方法优化(1)胡萝卜多糖制备取适量胡萝卜汁，按1:5质量体积比(g/mL)加入超纯水，于沸水浴中提取2.5h，过滤所得上清滤液，经浓缩后醇沉(最终乙醇质量体积浓度为80％)，4℃静置过夜后，在4800r/min转速下离心10min，除去上清液得到沉淀，加入超纯水复溶，然后除去糖溶液中的乙醇，真空浓缩、冻干，得到胡萝卜粗多糖。采用Saveg法对胡萝卜粗多糖进行脱蛋白处理，除去多糖溶液中的有机试剂后用超纯水透析48h，然后用95％乙醇再次对多糖溶液进行醇沉处理(最终乙醇浓度为80％)，4℃静置过夜，4800rpm转速下离心10min，得到的沉淀分别用乙醚、丙酮洗两次，然后除去多糖中残留的有机试剂，真空浓缩后冻干，得到胡萝卜多糖。(2)单糖组成分析准确称取胡萝卜多糖5mg于厚壁耐压管中，加入3mL一定浓度的TFA溶液后，进行第一步水解，反应结束后再冷却，旋转蒸发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酸性多糖中单糖组成的测定方法，其特征在于，由以下步骤组成：(1)多糖水解：称取5mg多糖，加入3mL三氟乙酸溶液加热进行第一步水解，反应结束后再冷却，之后加入3mL摩尔体积浓度(mol/L)为2的硫酸进行第二步水解，于100℃水解2h，水解完成后将样品溶液转移至250mL容量瓶定容，然后取稀释后的水解样品溶液并用0.22μm水系微孔滤膜过滤，取滤液用离子色谱仪分析；(2)检测条件：所述离子色谱仪为DIONEXICS‑5000，柱子采用CarboPacTMPA20分析柱3mm×150mm，柱温箱温度为30.0℃；检测系统为电化学检测器，检测温度为25.0℃；流动相由摩尔体积浓度(mol/L)为0.25的氢氧化钠溶液、摩尔体积浓度(mol/L)为1的醋酸钠溶液和超纯水组成，梯度洗脱。

【技术特征摘要】
1.一种酸性多糖中单糖组成的测定方法，其特征在于，由以下步骤组成：(1)多糖水解：称取5mg多糖，加入3mL三氟乙酸溶液加热进行第一步水解，反应结束后再冷却，之后加入3mL摩尔体积浓度(mol/L)为2的硫酸进行第二步水解，于100℃水解2h，水解完成后将样品溶液转移至250mL容量瓶定容，然后取稀释后的水解样品溶液并用0.22μm水系微孔滤膜过滤，取滤液用离子色谱仪分析；(2)检测条件：所述离子色谱仪为DIONEXICS-5000，柱子采用CarboPacTMPA20分析柱3mm×150mm，柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂少平，石惠方，万宇俊，谢明勇，殷军艺，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西,36