一种验证ELISA法和HPLC法之间存在相关性和线性关系的方法技术

本发明专利技术涉及一种验证ELISA法和HPLC法之间存在相关性和线性关系的方法，该方法利用ELISA法和HPLC法分别对待测样品进行检测，将各方法所检测得到的最终数据进行双样本均值分析，通过返回相关性检验值(chitest函数)来判断两种方法之间是否存在相关性，再通过对两组数据进行线性比对及线性拟合，得到方程，通过其相关系数和斜率等特征来判断两种方法是否具有线性关系；本发明专利技术同现有技术相比，具有步骤简单、操作方便等优点，并且在确定ELISA法和HPLC法是否具有相关性以及线性关系之后，可以用两种方法中人力财力投入相对较少、过程相对简单的去代替另一个人力财力投入相对较多、过程相对复杂的检测方法。

【技术实现步骤摘要】
一种验证ELISA法和HPLC法之间存在相关性和线性关系的方法[
]本专利技术属于环境科学领域，具体地说是一种验证ELISA法和HPLC法之间存在相关性和线性关系的方法。[
技术介绍
]微囊藻毒素(MC)是由蓝藻水华所产生的毒素，是蓝藻中的微囊藻属、鱼腥藻属、颤藻属及念珠藻属的某些种类和品系产生的次生代谢产物。微囊藻毒素通过影响水生生物，如浮游植物摄食者，无脊椎动物，鱼类和水生植物来调节水体中种群的组成和结构，从而影响蓝藻水华的形成和保持。微囊藻毒素是一种肝毒素，他对蛋白磷酸酶1A和2A的活性具有抑制作用，这与肿瘤促进作用有着直接的关系。由于微囊藻毒素(MC)分子量大且具有环状结构和间隔双键，因此MC在300℃的高温下也不易分解。这对人类和其他动物的生存构成了很大的威胁，因此受到广泛关注。其中，MC-LR的毒性在所有微囊藻毒素(MC)中最强。我国的蓝藻水华灾害是世界上危害最严重，灾害地域分布最广泛且水华蓝藻种类最多的国家之一，近几十年来，蓝藻水华灾害的爆发严重恶化了局部水域，频发生态灾害事件，供水安全也受到威胁。三大湖泊(太湖、滇池和巢湖)更是时常发生大面积蓝藻水华，俨然已发展成为一种“生态灾害”。这些严重的环境问题都是刻不容缓，等待解决的难题。因此，我国大力开展湖海蓝藻水华暴发机理及生态灾害形成原理研究，同时还加强对藻华衍生产物对水生生态系统各营养级水平上的毒理学研究。2007年5月底曾发生世界卫生组织(WHO)已制定出饮用水中MC的代表亚型MC-LR的基准值为1μg/L。因此，建立快速有效的检测方法是当务之急。目前使用或曾经使用的重要检测手段主要有：生物毒理学法、高效液相色谱法、联袂免疫法、蛋白磷酸抑制分析法等，其中，1.生物毒理学法：这是一种以毒理学和生化反应为基础的毒理学方法和生物测试方法来测定MC的方法，这一类方法大多仍采用小鼠测试法定性检测。此测试法结果直观，快速，但缺乏灵敏度和专一性，所需样品量大，目前有更简便，成本更低的盐水虾法来代替小鼠法，但和小鼠法一样缺乏专一性，受样品成分的干扰较大。2.高效液相色普法：这是一种利用高效液相色谱(HPLC-PDA)来进行MC的常规检测方法。此法利用分析中采用的固定相和流动相，通过等度和梯度洗脱，将MC的同分异构体分离，然后将得到纯化的毒素进行紫外检测，通过与标准毒素的出峰时间作比较，而对毒素种类进行定性鉴定，并利用峰面积比较法对毒素进行定量分析，该法是检测MC含量的常规方法之一，但此法需要采用标准毒素用来获取标准曲线和吸收峰面积值，目前标准毒素的缺乏在一定程度上限制了该方法的应用。3.联袂免疫法：这是一种利用MC诱发免疫反应，产生抗体，利用抗体对抗原的特异性识别来对藻毒素进行检测的方法，此类方法工作原理简单易行，分析速度快，灵敏度较高，但不能对藻毒素起到良好的鉴别作用，有时也会出现假阳性反应。4.蛋白磷酸抑制分析法：这是一种利用MC抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A的活性，依据这种特异性抑制程度对MC进行检测的方法。这种方法灵敏度高，测定用时短，适宜于环境检测，但它只反映MC的总量，不能用于藻毒素同系物的鉴别。[
技术实现思路
]本专利技术的目的就是要解决上述的不足而提供一种验证ELISA法和HPLC法之间存在相关性和线性关系的方法，该方法可通过验证上述两种方法之间存在的相关性和线性关系，来甄选出两种方法中人力物资投入较少、过程较为简单、操作较为方便的方法，从而可解决铜绿微囊藻藻毒素MC-LR定量方法中存在的准确性低、成本高等技术问题。为实现上述目的设计一种验证ELISA法和HPLC法之间存在相关性和线性关系的方法，包括以下步骤：利用ELISA法和HPLC法分别对待测样品进行检测，将两种方法检测得到的最终数据进行双样本均值分析，通过返回相关性检验值来判断两种方法之间是否存在相关性；再通过对两组数据进行线性比对及线性拟合，得到方程，通过其相关系数和斜率来判断两种方法是否具有线性关系。进一步地，所述ELISA法和HPLC法均采用外标法检测数据。本专利技术所述的验证ELISA法和HPLC法之间存在相关性和线性关系的方法，包括以下步骤，1)培养待测蓝藻藻液样品的步骤：准备好相对应的培养基，培养基为高压灭菌的BG-11，取5-10mL藻液加入到配制好的BG11灭菌培养液中，控制其初始吸光度，使其一致，培养几天后，若微囊藻的生长状况较好，藻菌数量在肉眼观察下增多，微囊藻的外观颜色较好，则对微囊藻按藻液:培养基为1:5的接种比例再次进行转接培养；然后将培养7天后的铜绿微囊藻原样按照1:5的接种比例转接到6个250mL的锥形瓶，控制初始吸光度A＝0.1；2)样品预处理的步骤：ELISA法：取藻液15mL，三组平行，置于细胞破碎仪中超声破碎8min，之后于0℃、8000r/min条件下进行冷冻离心分离拿出进行冷冻离心，然后取清夜为样品；HPLC法：取藻液15mL，三组平行，置于细胞破碎仪中超声破碎8min，之后于0℃、8000r/min条件下进行冷冻离心分离拿出进行冷冻离心，取清液，再将萃取柱装在萃取仪上，将清夜倒入萃取柱中进行萃取，萃取后得到的粗液进行氮吹，吹干后，用甲醇进行溶解，针管过滤，装入检测瓶内，为样品；3)用ELISA法检测微囊藻毒素：将微囊藻毒素酶免检测试剂盒取出，在室温下放置15min以上，放置需要的微孔在反应板的支架上，用配置好的洗涤液洗涤2次，每一次间隔时长为1min，之后拍干；设定酶标仪调零孔为1号孔，微囊藻毒素MC-LR标准样品对照孔为2-6号孔，其余均为待测样品孔，分别在1-6号孔内加入50μL浓度分别为0ng/L、100ng/L、250ng/L、500ng/L、1000ng/L、2000ng/L的标准品，在其他小孔加入对应的待测样品前处理液，摇匀，使用移液枪在小孔中加入50μL，摇匀，使各孔中第一抗体溶液与待测样品混匀；在37℃、静态的环境下，孵育60分钟，孵育结束后，倒掉反应板中液体，使用移液枪在每个小孔中加入约250μL洗涤液，洗液不超过小孔体积，放置1分钟，之后甩掉洗液，于滤纸上轻轻拍干，重复操作3次；再使用移液枪在每个小孔中加入100μL酶标二抗溶液，在37℃、静态的环境下，摇匀，孵育30分钟，孵育结束后，倒掉反应板中液体，使用移液枪在每个小孔中加入250μL洗涤液，洗液不超过小孔体积，放置1分钟，之后甩掉洗液，取新滤纸，于滤纸上轻轻拍干，重复操作5次；然后使用移液枪在每个小孔中加入50μL底物液后，再加入50μL显色液，摇匀，在37℃、静态的环境下显色15分钟，使用移液枪在每个小孔中加入50μL反应终止液，微微摇动反应板，并在30分钟内用酶标仪于450nm处测得光密度OD值，测定条件为37℃、波长450nm，横纵坐标轴分别选择藻毒素浓度和光密度；4)用HPLC法检测MC-LR浓度：配置一系列MC-LR标准溶液，并取样于进样瓶内，在高效液相色谱仪工作站上绘制标准曲线，将处理好的样品置于托盘，直接进样，由高效液相色谱仪进行检测，通过工作站采集检测数据，再与标线进行比对，利用外标法计算结果；色谱分析条件：柱温40℃，流速1mL/min，流动相：V甲醇:V水＝65：35，紫外检测波长238nm，进样量10μL，色谱柱规格为Promosil4.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种验证ELISA法和HPLC法之间存在相关性和线性关系的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用ELISA法和HPLC法分别对待测样品进行检测，将两种方法检测得到的最终数据进行双样本均值分析，通过返回相关性检验值来判断两种方法之间是否存在相关性；再通过对两组数据进行线性比对及线性拟合，得到方程，通过其相关系数和斜率来判断两种方法是否具有线性关系。

【技术特征摘要】
1.一种验证ELISA法和HPLC法之间存在相关性和线性关系的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用ELISA法和HPLC法分别对待测样品进行检测，将两种方法检测得到的最终数据进行双样本均值分析，通过返回相关性检验值来判断两种方法之间是否存在相关性；再通过对两组数据进行线性比对及线性拟合，得到方程，通过其相关系数和斜率来判断两种方法是否具有线性关系。2.如权利要求1所述的验证ELISA法和HPLC法之间存在相关性和线性关系的方法，其特征在于：所述ELISA法和HPLC法均采用外标法检测数据。3.如权利要求1所述的验证ELISA法和HPLC法之间存在相关性和线性关系的方法，其特征在于，包括以下步骤，1)培养待测蓝藻藻液样品的步骤：准备好相对应的培养基，培养基为高压灭菌的BG-11，取5-10mL藻液加入到配制好的BG11灭菌培养液中，控制其初始吸光度，使其一致，培养几天后，若微囊藻的生长状况较好，藻菌数量在肉眼观察下增多，微囊藻的外观颜色较好，则对微囊藻按藻液:培养基为1:5的接种比例再次进行转接培养；然后将培养7天后的铜绿微囊藻原样按照1:5的接种比例转接到6个250mL的锥形瓶，控制初始吸光度A＝0.1；2)样品预处理的步骤：ELISA法：取藻液15mL，三组平行，置于细胞破碎仪中超声破碎8min，之后于0℃、8000r/min条件下进行冷冻离心分离拿出进行冷冻离心，然后取清夜为样品；HPLC法：取藻液15mL，三组平行，置于细胞破碎仪中超声破碎8min，之后于0℃、8000r/min条件下进行冷冻离心分离拿出进行冷冻离心，取清液，再将萃取柱装在萃取仪上，将清夜倒入萃取柱中进行萃取，萃取后得到的粗液进行氮吹，吹干后，用甲醇进行溶解，针管过滤，装入检测瓶内，为样品；3)用ELISA法检测微囊藻毒素：将微囊藻毒素酶免检测试剂盒取出，在室温下放置15min以上，放置需要的微孔在反应板的支架上，用配置好的洗涤液洗涤2次，每一次间隔时长为1min，之后拍干；设定酶标仪调零孔为1号孔，微囊藻毒素MC-LR标准样品对照孔为2-6号孔，其余均为待测样品孔，分别在1-6...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶璟，陈佳文，王春晖，黄晨，聂犇，
申请(专利权)人：上海应用技术大学，
类型：发明
国别省市：上海,31