肝细胞增殖相关circ_1366的筛选、检测、应用和抑制肝细胞的调节物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种肝细胞增殖相关circ_1366的筛选、检测、应用和抑制肝细胞的调节物及其应用，所述circRNA为circ_1366，其序列如SEQ ID NO.1所示，该circRNA的筛选方法为：构建大鼠肝再生模型，从肝再生模型中提取总RNA，然后通过筛选得到如SEQ ID NO.1所示的circRNA。抑制RNA能够与该circRNA相互作用并通过干涉circRNA表达实现抑制肝细胞增殖。本申请的抑制RNA可进一步制成以该circRNA为靶点来抑制肝癌细胞的药物。

Screening, Detection, Application and Inhibitor of Hepatocyte Proliferation-related Circ_1366 and Its Application

The present invention relates to the screening, detection, application and application of circ_1366, a regulator of circ_1366 related to hepatocyte proliferation, and its application. The CIRC RNA is circ_1366. Its sequence is shown in SEQ ID NO.1. The CIRC RNA screening method is to construct a rat liver regeneration model, extract total RNA from the liver regeneration model, and then obtain CIRC RNA as shown in SEQ ID NO.1 through screening. Inhibitory RNA can interact with circRNA and inhibit hepatocyte proliferation by interfering with circRNA expression. The inhibitory RNA can be further prepared into a drug targeting the circRNA to inhibit hepatocellular carcinoma cells.

【技术实现步骤摘要】
肝细胞增殖相关circ_1366的筛选、检测、应用和抑制肝细胞的调节物及其应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及与肝细胞增殖相关circ_1366的筛选、检测、应用、抑制肝细胞的调节物及调节物的应用。
技术介绍
肝脏是人体的最大内脏器官，参与蛋白质合成和许多生理活动，包括代谢、解毒和防御，并在体内稳态中起极其关键的作用。许多因素可损害肝脏，如肿瘤、感染、药物、毒物和手术等。肝切除手术后，残肝会发生肝再生，恢复正常的肝结构和稳态，因此，解码肝的再生能力及机制有重要意义。随着生物高通量测序技术的迅速发展，生物体中诸多的circRNA被挖掘。由于circRNA有不易被RNA外切酶降解、能与miRNA发生交互作用等特性，因而可与内源性RNA竞争。circRNA通过与疾病相关的miRNA相互作用，在多种癌、帕金森病、阿尔茨海默病、糖尿病和软骨退化等疾病中发挥重要作用。本申请人通过研究发现，circ_1366表达水平与细胞增殖和凋亡紧密相关，而抑制其表达对肝细胞增殖具有显著影响，因此，其在与肝病治疗中具有重要的应用。
技术实现思路
有鉴于此，专利技术的目的是提供一种肝细胞增殖相关circ_1366的筛选、检测、应用和抑制肝细胞的调节物及其应用，解决了现有技术中存在的不足。专利技术的目的是通过以下技术方案来实现：本专利技术的一个目的为提供一种与肝再生相关circRNA的筛选方法，该筛选方法即为本专利技术的一个专利技术点。所述circRNA为circ_1366，其序列如SEQIDNO.1所示，该circRNA的筛选方法为：构建大鼠肝再生模型，从肝再生模型中提取总RNA，然后通过筛选得到如SEQIDNO.1(即序列表中的第一个序列)所示的circRNA。本专利技术的另一个目的为提供一种所述circ_1366的检测方法，该检测方法尤其是引物序列的使用为本专利技术的另一个专利技术点。所述检测方法为采用实时荧光定量PCR检测，实时荧光定量PCR中的引物包括circ_1366上游引物和circ_1366下游引物，所述circ_1366上游引物和circ_1366下游引物分别为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3。优选地，所述实时荧光定量PCR中还包括内参上游引物和内参下游引物，所述内参上游引物和内参下游引物分别如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。本专利技术的又一个目的为提供一种能够调节肝细胞增殖的作用靶点，该调节肝细胞增殖的作用靶点的确定为本专利技术的又一个专利技术点。所述靶点为所述的circRNA，该circRNA的碱基序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，所述circRNA的干涉分子为抑制RNA，抑制RNA能够通过干涉circ-RNA的表达而抑制肝细胞的增值，该抑制RNA的碱基序列如SEQIDNO.7所示。本专利技术的再一个目的为提供一种能够抑制肝细胞增殖的调节物，该调节物的选择为本专利技术的再一个专利技术点。所述调节物包括能够与circRNA相互作用并通过干涉circRNA表达实现抑制肝细胞增殖的抑制RNA；该抑制RNA的碱基序列如SEQIDNO.7所示。本专利技术还有一个目的为提供一种抑制肝细胞增殖的方法，所述方法为通过加入上述的抑制RNA来干涉circ_1366，最终实现抑制肝细胞增殖的目的；该方法也是本专利技术的一个专利技术点。本专利技术最后一个目的为提供一种肝细胞的调节物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，将所述抑制RNA与circRNA作用并以此实现抑制肝细胞增值，从而实现获得抗肿瘤的药物为本专利技术的最后一个专利技术点。所述调节物包括上述的能够与circRNA进行作用并抑制circRNA表达的抑制RNA；所述抑制RNA能够抑制细胞增殖从而能够作为抑制肿瘤的增长或转移的抗癌药物；所述肿瘤包括肝脏肿瘤。专利技术提供了一种肝细胞增殖相关circ_1366的筛选、检测、应用和抑制肝细胞的调节物及其应用，其至少具有以下有益效果：本专利技术通过特定的方法成功筛选出再生肝的细胞增殖相关circRNA分子，其可作为调节肝细胞增殖的靶点；本专利技术还研究设计出能够与circRNA作用并抑制circRNA表达的RNA干涉分子，即抑制RNA，该抑制RNA具有较强的特异性，其基本只对circ_1366起作用，不影响肝脏细胞中其它分子的正常运作，与circ_1366相互作用的该RNA干涉分子能够作为抑制肝细胞增殖的药物，并能进一步制成抑制癌症的药物，该抑制RNA与circRNA相互作用后，能够有效调节肝细胞的增殖情况，意义重大。总之，
技术实现思路
中所记载的内容为本申请的主要专利技术点。上述的调节物可应用于肝癌的临床早期诊断、预后判断或靶向治疗，并有利于进一步阐明肝再生及肝癌发生发展机理、信号通路等，有利于为开发相关药物提供高效的、大通量的筛选和评价平台及手段，将大大促进circRNA在肿瘤预防、诊断和治疗中的应用。附图说明图1为用qRT-PCR技术检测的circ_1366在大鼠肝再生中的表达情况；图2为用qRT-PCR技术检测的circ_1366的抑制分子在BRL-3A细胞中的抑制效率；图3为用MTT法检测的circ_1366的抑制分子对BRL-3A细胞活性的影响；图4为用流式细胞术检测的对照组中对BRL-3A细胞周期的影响；图5为用流式细胞术检测的circ_1366的干涉分子对BRL-3A细胞周期的影响；图6为细胞周期分布统计分析结果。具体实施方式下面对专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。以下提供的专利技术的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的专利技术的范围，而是仅仅表示专利技术的选定实施例。基于专利技术中的实施例，本领域普通方法人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于专利技术保护的范围。实施例1：大鼠肝再生模型制备与取材实验用大鼠为成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重230±20g，由河南师范大学实验动物中心提供。取60只成年健康雄性SD大鼠，随机分为10组，每组6只。其中1组用作正常对照，其余9组用于2/3肝切除手术(paritalhepatectomy，PH)。根据Higgins等建立的方法制备肝再生模型。具体操作方法为：用乙醚麻醉大鼠，用75％酒精对其腹部进行消毒处理，无菌条件下，距剑突下方约2cm处沿腹中线剪开腹壁至剑突处，然后挤出肝脏的左叶和中叶(约为肝脏总重的2/3)并切除，用手术线缝合切口，并撒上适量磺胺颗粒以防感染。术后12h内大鼠禁食、禁水。于手术后0、2、6、12、24、30、36、72、120和168h时分别收集肝右叶，用液氮将其速冻，存放在-80℃低温冰箱备用。本实验严格遵循中国《实验动物福利伦理指南》。实施例2：总RNA的提取取适量实施例1中各个时间段下存于-80℃的大鼠肝组织样本，迅速放到液氮预冷的研钵中，在液氮浴的条件下尽快研磨肝组织成粉末状。然后，将样品粉末转移到含Trizol的离心管内，剧烈震荡，彻底裂解组织。接着按Trizol试剂盒说明书分别提取各个时间段下大鼠肝组织样本中的总RNA，于-80℃保存。实施例3：RNA定量与纯度分析用Trizol法提取总RNA后，用紫外分光光度计检测RNA浓度。RNA样品的OD260/OD280值在1.8-2.2之间，OD260/OD230值在2.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与肝再生相关circRNA的筛选方法，其特征在于：所述circRNA为circ_1366，其序列如SEQ ID NO.1所示，该circRNA的筛选方法为：构建大鼠肝再生模型，从肝再生模型中提取总RNA，然后通过筛选得到如SEQ ID NO.1所示的circRNA。

【技术特征摘要】
1.一种与肝再生相关circRNA的筛选方法，其特征在于：所述circRNA为circ_1366，其序列如SEQIDNO.1所示，该circRNA的筛选方法为：构建大鼠肝再生模型，从肝再生模型中提取总RNA，然后通过筛选得到如SEQIDNO.1所示的circRNA。2.一种根据权利要求1所述的circ_1366的检测方法，其特征在于：所述检测方法为采用实时荧光定量PCR检测，实时荧光定量PCR中的引物包括circ_1366上游引物和circ_1366下游引物，所述circ_1366上游引物和circ_1366下游引物分别为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR中还包括内参上游引物和内参下游引物，所述内参上游引物和内参下游引物分别如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。4.一种能够调节肝细胞增殖的作用靶点，其特征在于：所述靶点为所述的circRNA，该circRNA的碱基序列如SEQIDNO.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐存拴，张照可，王改平，郭建林，郭学强，靳伟，白格，李莉菲，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南,41