一种山羊MYLK4基因CNV标记的检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种山羊MYLK4基因CNV标记的检测方法及其应用。该方法基于实时荧光定量PCR，以山羊基因组DNA为模板，扩增山羊MYLK4基因的拷贝数变异区域，接着运用‑ΔΔCt计算并根据结果判定个体的拷贝数变异类型。本发明专利技术利用个体的CNV类型与生长性状进行关联分析。本发明专利技术所提供的检测方法为MYLK4基因拷贝数变异与山羊生长性状关系的建立奠定了理论基础，该方法简单快捷，便于推广使用，有利于加快建立种质资源优良的山羊种群。

A Method for Detecting CNV Markers of MYLK4 Gene in Goats and Its Application

The invention discloses a detection method for CNV marker of goat MYLK4 gene and its application. The method is based on real-time fluorescence quantitative PCR, using goat genomic DNA as template, amplifying the copy number variation region of goat MYLK4 gene, and then using CT to calculate and determine the type of individual copy number variation according to the results. The present invention utilizes individual CNV type and growth traits for correlation analysis. The detection method provided by the invention lays a theoretical foundation for the establishment of the relationship between MYLK4 gene copy number variation and Goat Growth traits. The method is simple, fast, easy to popularize and use, and is conducive to speeding up the establishment of goat population with excellent germplasm resources.

【技术实现步骤摘要】
一种山羊MYLK4基因CNV标记的检测方法及其应用
本专利技术属于遗传育种领域，具体涉及一种MYLK4基因拷贝数变异(CNV)标记的检测方法及其在提高山羊生长性状的分子育种中的应用。
技术介绍
随着基因组学和生物信息学等相关学科的迅猛发展，动物遗传育种的理论和技术也发生了重大的变化，即逐渐由传统的常规表型选育转向分子选育。目前，分子育种的研究主要集中在标记辅助选择(molecularmark-assistselection,MAS)，该技术是通过DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。拷贝数变异(CopyNumberVariations,CNVs)是指基因组中大于50bp到数Mb之间的片段插入、缺失复制和复杂的重组的现象。CNVs作为一种基因组亚显微水平结构变异类型，可以通过剂量效应、位置效应、阻断功能基因、融合基因、暴露隐性等位基因和潜在的跃迁效应来影响基因的功能以及个体的表型。在检测已知CNV的各种方法中，qPCR是使用比较广泛的一种技术。该方法操作简单、敏感性高、速度快。其在PCR中选取单拷贝的基因，作为内参基因，然后利用2-ΔΔCt的方法判定个体的拷贝数变异类型以及相对拷贝数。MYLK4基因作为MYLK家族中的重要成员，依赖于Ca2+/钙调蛋白(CaM)的调节，能够有选择性地和非共价地与ATP相互作用，发生蛋白质磷酸化，即使肌球蛋白调节性轻链(myosinregulatorylightchain,RLC)磷酸化，RLC的磷酸化可提高肌球蛋白ATPase活性，进而调控基于肌动蛋白与肌球蛋白之间的相互作用和细胞骨架活动，引起收缩活性，因此，MYLK4在肌肉收缩、细胞运动、损伤修复、细胞凋亡、分泌活动、上皮细胞通透性改变、细胞内信号转递和血小板形态的改变等方面起着重要的作用。目前相关研究表明，MYLK4与心力衰竭、小肠蠕动失弛缓症、肉牛的生长发育等病理、生理有着密切的联系。关于MYLK4基因的功能，根据在人和小鼠上所做的研究，发现其对细胞生长的调控以及疾病发作上有重要影响，但在山羊上的报道较少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种山羊MYLK4基因CNV标记的检测方法及其应用。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种检测山羊MYLK4基因CNV标记的方法，包括以下步骤：以提取自待测山羊(例如，努比亚山羊和黑山羊)的耳组织的全基因组DNA为模板，以引物对P1和P2分别通过实时荧光定量PCR(qPCR)技术扩增山羊MYLK4基因的拷贝数变异区域和山羊MC1R基因的部分片段，其中基于引物对P2的扩增在定量中起对照作用，然后根据定量结果鉴定山羊MYLK4基因的拷贝数变异类型。优选的，所述的CNV标记位于MYLK4基因候选区域Chr23：1453501-1455500(参考序列：NC_030830.1)的拷贝数变异区域。优选的，根据Log22-ΔΔCt(即-ΔΔCt)将拷贝数变异类型分为：插入型，Log22-ΔΔCt>0.5；缺失型，Log22-ΔΔCt<-0.5；或正常型，Log22-ΔΔCt≤|±0.5|。优选的，所述的引物对P1为：上游引物F：5’-CATTGAAGGGGGACAGCCATC-3’；下游引物R：5’-AGGCTGTTAGCACTTGCGGGA-3’。优选的，所述的引物对P2为：上游引物F：5’-CTCGTTGGCCTCTTCATAGC-3’；下游引物R：5’-GAAGTTCTTGAAGATGCAGCC-3’。优选的，所述的实时定量PCR所用的扩增反应体系以12.5μL计，包括：10ng/μL模板DNA1μL、10μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL以及PremixExTaqTMII6.25μL和ddH2O4.25μL。优选的，所述的实时定量PCR所用的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。优选的，基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为129bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为267bp。上述检测山羊MYLK4基因CNV标记的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。优选的，所述拷贝数变异类型中，具有缺失型的个体在生长性状上较优。优选的，所述生长性状为体重、体高、体长或胸围。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术提出了一种检测山羊MYLK4基因拷贝数变异的方法，该方法利用基因组DNA实时定量PCR，以MC1R基因为参照，根据2-ΔΔCt值即可确定个体MYLK4基因拷贝数变异的类型。与现有技术相比，本专利技术有以下优点：(1)本专利技术提供的山羊MYLK4基因拷贝数变异检测方法，不受年龄的限制，可用于早期选育，甚至在刚出生时就可进行选择；(2)检测山羊MYLK4基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便；(3)山羊MYLK4基因拷贝数变异位点的拷贝数变异类型的检出，为山羊生长发育的分子标记辅助选择提供科学依据。本专利技术根据山羊MYLK4基因候选区域Chr23:1453501-1455500内的拷贝数变异，以待测山羊的基因组DNA为模板，利用实时荧光定量PCR检测基因组中所新发现的CNV，根据Log22-ΔΔCt将定量结果分为三类：即拷贝数变异类型分别为插入型、缺失型和正常型。根据山羊基因组CNV的检测结果，在山羊MYLK4基因具有缺失型拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优。根据本专利技术的实施例，以山羊MYLK4基因候选区域Chr23:1453501-1455500为候选位点，通过实时荧光定量PCR技术检测该位点在努比亚山羊和黑山羊群体中的拷贝数变异情况，并与体重、体高、体长和胸围等重要经济性状进行关联分析；如果检测山羊个体MYLK4基因候选位点的CNV类型为缺失型，则山羊个体体高和体长显著优于其他类型的个体。附图说明图1为利用普通PCR扩增验证引物对P1扩增产物的特异性的电泳图谱：泳道1为Marker，泳道2为引物对P1扩增的目标序列。图2为本专利技术中进行qPCR绘制的扩增曲线。图3是本专利技术中进行qPCR绘制的溶解曲线。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。本专利技术利用实时荧光定量PCR对山羊MYLK4基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：(1)利用NCBI数据库找到MYLK4基因序列，再用Primer5软件进行引物设计，并用普通PCR检测引物；(2)采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况，筛选到与山羊生长性状相关的CNV标记；(3)利用SPSS23.0软件将拷贝数变异类型与山羊生长性状等进行关联分析；(4)根据拷贝数变异类型进行生长性状优异的山羊选育。1、山羊样本采集本专利技术具体以努比亚山羊和黑山羊共226头作为检测对象，2个品种耳组织均采集自贵州省毕节市(2017年7月采集)，并记录他们的生长性状数据，如体重、体高、体长、胸围等，以用于后续的关联分析。2、耳组织基因组DNA的提取(1)取30mg组织样品放入2.0mL离心管，用手术剪将组织样剪碎本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测山羊MYLK4基因CNV标记的方法，其特征在于：包括以下步骤：以待测山羊的基因组DNA为模板，以引物对P1和P2分别通过实时荧光定量PCR扩增山羊MYLK4基因的拷贝数变异区域和山羊MC1R基因的部分片段，其中基于引物对P2的扩增作为定量的对照，然后根据定量结果鉴定山羊MYLK4基因的拷贝数变异类型。

【技术特征摘要】
1.一种检测山羊MYLK4基因CNV标记的方法，其特征在于：包括以下步骤：以待测山羊的基因组DNA为模板，以引物对P1和P2分别通过实时荧光定量PCR扩增山羊MYLK4基因的拷贝数变异区域和山羊MC1R基因的部分片段，其中基于引物对P2的扩增作为定量的对照，然后根据定量结果鉴定山羊MYLK4基因的拷贝数变异类型。2.根据权利要求1所述一种检测山羊MYLK4基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的CNV标记位于MYLK4基因候选区域Chr23：1453501-1455500。3.根据权利要求1所述一种检测山羊MYLK4基因CNV标记的方法，其特征在于：根据Log22-ΔΔCt将拷贝数变异类型分为：插入型，Log22-ΔΔCt>0.5；缺失型，Log22-ΔΔCt<-0.5；正常型，Log22-ΔΔCt≤|±0.5|。4.根据权利要求1所述一种检测山羊MYLK4基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的引物对P1为：上游引物F：5’-CATTGAAGGGGGACAGCCATC-3’；下游引物R：5’-AGGCTGTTAGCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄永震，师书玥，李丽娟，徐琳娜，张子敬，王献伟，贺花，陈宏，雷初朝，胡沈荣，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61