一种普鲁兰酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种普鲁兰酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明专利技术构建了一种普鲁兰酶突变体，得到的单突变体K419R(第419位赖氨酸突变为精氨酸)的酶活是野生型的1.3，67℃保温30min剩余酶活达67.3U/mg；迭代突变体K419R+Y102C+K383C(第419位赖氨酸突变为精氨酸，第102位酪氨酸和第383位赖氨酸分别突变为半胱氨酸)的酶活提高为野生型的2倍，在67℃保温30min剩余酶活达88.3U/mg，为保温前的43.1％，具有较好的热稳定性。本发明专利技术的普鲁兰酶突变体能够应用于淀粉糖化过程。

A Plulanase Mutant and Its Application

The invention discloses a pullulanase mutant and its application, belonging to the field of genetic engineering and enzyme engineering technology. The invention constructs a pullulanase mutant, and the enzyme activity of the single mutant K419R (419 lysine mutated to arginine) obtained is 1.3 of the wild type, and the residual enzyme activity reaches 67.3U/mg after 30 minutes at 67 C; the enzyme activity of the iterative mutant K419R+Y102C+K383C (419 lysine mutated to arginine, 102 tyrosine and 383 lysine mutated to cysteine respectively) is increased to wild type. The residual enzyme activity was 88.3U/mg, 43.1% of that before incubation, and had good thermal stability. The pullulanase mutant of the invention can be applied to the starch saccharification process.

【技术实现步骤摘要】
一种普鲁兰酶突变体及其应用
本专利技术涉及一种普鲁兰酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程

技术介绍
普鲁兰酶是α-1,6-糖苷键水解酶，能够专一、高效地切割支链淀粉中的支链，被广泛地应用于现代淀粉糖工业中，成为高品质糖浆生产过程中的关键酶制剂。淀粉糖化过程需要在高温(60-65℃)下进行，糖化时间一般为48-60h，因此，普鲁兰酶必须具备在高温下保持较高酶活性和稳定性的能力。淀粉糖化生产的葡萄糖浆不但可以生产结晶葡萄糖、高果糖浆，还可以作为最主要的发酵碳源，因此现阶段对能够与糖化酶复配的普鲁兰酶的开发也尤为重要。近年来，国内对普鲁兰酶的研究逐渐升温，取得了许多较好的研究成果，但是在高活性、耐热普鲁兰酶的开发上仍然存在一些问题，主要表现为开发的普鲁兰酶难以同时满足淀粉糖化过程对普鲁兰酶性质的苛刻要求。本专利技术使用的野生型普鲁兰酶在最适反应条件下比酶活为102.7±1.7U/mg，67℃保温30min残余酶活仍剩余50％以上。其热稳定性较诺维信公司的商业普鲁兰酶(60℃，pH5.0条件下半衰期仅为35min)有明显优势。因此，如果能够通过基因工程和分子生物学手段对本专利技术使用的野生型普鲁兰酶进行酶学性质改造，提高其比活力，那么就可能打破国外公司对该酶的长期垄断地位，使我国在普鲁兰酶工业应用领域有自主产权和技术。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种普鲁兰酶突变体，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQIDNO.1的普鲁兰酶第419位氨基酸进行突变；或，同时将出发氨基酸序列为SEQIDNO.1的普鲁兰酶第419位、第102位、第383位氨基酸进行突变。在本专利技术的一种实施方式中，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQIDNO.1的普鲁兰酶第419位赖氨酸突变为精氨酸得到的，突变体命名为K419R。在本专利技术的一种实施方式中，所述酶突变体是通过同时将出发氨基酸序列为SEQIDNO.1的普鲁兰酶第419位赖氨酸突变为精氨酸、第102位酪氨酸突变为半胱氨酸、第383位氨基酸赖氨酸突变为半胱氨酸得到的，突变体命名为K419R+Y102C+K383C。所述普鲁兰酶的来源为Anoxybacillussp.WB42。所述普鲁兰酶突变体的基因。携带普鲁兰酶突变体基因的载体。本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供一种普鲁兰酶突变体的方法，包括如下步骤：(1)在普鲁兰酶氨基酸序列上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带普鲁兰酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，分别纯化普鲁兰酶突变体K419R和迭代突变体K419R+Y102C+K383C。携带普鲁兰酶突变体的基因或普鲁兰酶突变体基因的载体的宿主细胞。所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。所述普鲁兰酶突变体在淀粉糖化中的应用。本专利技术取得的有益效果：本专利技术构建了一种普鲁兰酶突变体，得到的单突变体K419R(第419位赖氨酸突变为精氨酸)的酶活是野生型的1.3倍，67℃保温30min剩余酶活为67.3U/mg；迭代突变体K419R+Y102C+K383C(第419位赖氨酸突变为精氨酸，第102位酪氨酸和第383位赖氨酸分别突变为半胱氨酸)的酶活是野生型的2倍，67℃保温30min剩余酶活为88.3U/mg，是保温前的43.1％，具有较好的热稳定性。本专利技术的环普鲁兰酶突变体能够应用于淀粉糖化中。附图说明图1pET-22b(+)-pulA定点突变全质粒PCR结果，其中1表示DNAmarker；2表示pET-22b(+)-pulA定点突变全质粒PCR结果。图2普鲁兰酶的纯化结果，其中1表示proteinmarker；2表示纯化后的普鲁兰酶。具体实施方式本专利技术的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下述实施例中涉及的培养基、缓冲液如下：LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠10g/L。LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L。LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠10g/L。结合缓冲溶液：50mmol/LNa2HPO4、50mmol/LNaH2PO4、500mmol/LNaCl、20mmol/L咪唑。磷酸盐缓冲液：50mmol/LNa2HPO4、50mmol/LNaH2PO4、500mmol/LNaCl。实施例1：重组菌构建根据来源于Anoxybacillussp.WB42(WangJ，LiuZ，ZhouZ.CloningandcharacterizationofanovelthermophilicamylopullulanasewithatypeIpullulanasestructurefromAnoxybacillussp.WB42[J].2018，70(5-6)：1700265.doi：10.1002/star.201700265)的普鲁兰酶如SEQIDNO.2所示的碱基序列，设计普鲁兰酶的克隆引物如表1所示，用于构建大肠杆菌的质粒是pET-22b(+)，带有NdeI、XhoI酶切位点。将普鲁兰酶克隆至载体pET-22b(+)的NdeI、XhoI酶切位点之间，得到重组质粒pET-22b(+)-pulA。步骤如下：(1)普鲁兰酶克隆引物的设计；(2)以Anoxybacillussp.WB42为模板对基因pulA进行PCR克隆；(3)将上述PCR产物进行回收纯化，用限制性内切酶NdeI、XhoI分别对纯化后的PCR产物和载体pET-22b(+)进行双酶切，之后对酶切产物回收纯化；(4)将酶切纯化后的PCR产物和载体在DNA连接酶的作用下连接过夜，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落进行测序。实施例2：普鲁兰酶突变体的制备(1)单突变体根据如SEQIDNO.2所示的普鲁兰酶的基因序列，设计并合成引入突变体K419R的引物，利用快速PCR技术，以携带编码野生型普鲁兰酶的基因的重组质粒pET-22b(+)-pulA为模板，对普鲁兰酶基因进行定点突变，测定DNA编码序列，鉴别出第419位赖氨酸密码子变成精氨酸密码子，得到单突变体普鲁兰酶K419R。引入K419R突变的定点突变引物为：核苷酸序列为SEQIDNO.3的正向引物：5’-GCATTCTCGATATTGACACGATGCGTGAAGTC-3’(下划线为突变碱基)核苷酸序列为SEQIDNO.4的反向引物：5’-ACAACTGCCTCGACTTCACGCATCGTGTC-3’(下划线为突变碱基)PCR反应体系见表1：表1PCR反应体系PCR扩增条件为：94℃预变性5min；随后25个循环(98℃10s，55℃30s，72℃2min)；72℃继续延伸10min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1。将验证正确的PCR产物经DpnⅠ消化，转化大肠杆菌JM109感受态，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)上，挑克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养后提取质粒，所有突变质粒均测序正确，得到的重组菌分别命名为E.coliJM109/pET-22b(+)-pulA(K419R)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的普鲁兰酶第419位氨基酸进行突变；或，同时将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的普鲁兰酶第419位、第102位、第383位氨基酸进行突变。

【技术特征摘要】
1.一种普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQIDNO.1的普鲁兰酶第419位氨基酸进行突变；或，同时将出发氨基酸序列为SEQIDNO.1的普鲁兰酶第419位、第102位、第383位氨基酸进行突变。2.根据权利要求1所述的普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQIDNO.1的普鲁兰酶第419位赖氨酸突变为精氨酸得到的，突变体命名为K419R。3.根据权利要求1所述的普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述酶突变体是通过同时将出发氨基酸序列为SEQIDNO.1的普鲁兰酶第419位赖氨酸突变为精氨酸、第102位酪氨酸突变为半胱氨酸、第383位氨基酸赖氨酸突变为半胱氨酸得到的，突变体命名为K419R+Y102C+K383C。4.根据权利要求1-3任一所述的普鲁兰酶突变体...

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，周丽，崔文璟，刘中美，庞博，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32