一种来源于三角帆蚌基因的重组溶菌酶制造技术

本发明专利技术公开了一种来源于三角帆蚌基因的重组溶菌酶，所述重组溶菌酶的编码序列为SEQ ID No.1所示核苷酸序列，所述重组溶菌酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明专利技术的重组溶菌酶具有较宽的pH值耐受范围，且对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均具有抑菌效果，对革兰氏阳性菌的抑菌效果更明显，具有广泛的应用前景。

A Recombinant Lysozyme Derived from Hyriopsis cumingii Gene

The invention discloses a recombinant lysozyme derived from Hyriopsis cumingii gene. The coding sequence of the recombinant lysozyme is the nucleotide sequence shown in SEQ ID No.1, and the amino acid sequence of the recombinant lysozyme is shown in SEQ ID No.2. The recombinant lysozyme of the invention has a wide pH tolerance range, and has bacteriostatic effect on both Gram-positive and Gram-negative bacteria, and has more obvious bacteriostatic effect on Gram-positive bacteria, and has a wide application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种来源于三角帆蚌基因的重组溶菌酶
本专利技术涉及一种溶菌酶，特别涉及一种来源于三角帆蚌基因的重组溶菌酶。
技术介绍
对虾是浅海最占优势的重要经济水产养殖动物。中国对虾养殖业发展迅速，然而，目前的养殖平均成功率只有20-30％。其中，对虾早期死亡综合征EMS(EarlyMortalitySyndrome)及急性肝胰脏坏死的发生给对虾养殖业造成了巨大影响，严重制约其持续性发展。在过去的20年，人们采用各种抗生素治疗对虾类的感染性疾病，并取得了一定的效果。然而滥用抗生素存在安全性和抗药性的隐患。首先，畜产品中抗生素的残留以及养殖过程中长期使用抗生素会导致畜禽免疫功能下降。其次，水产集约化养殖导致了抗生素残留、耐药性等问题，不仅抑制了水产养殖业的发展，而且对人体也有一定的损害。同时，水产品中添加的化学保鲜剂也引起了人们的警觉。因此，寻找抗生素的替代品是解决问题的一条非常有效的途径。溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)，是一种碱性水溶性蛋白酶。它主要通过切断细胞壁肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，细菌裂解。溶菌酶可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。大多数溶菌酶对于革兰氏阳性菌的细胞壁破坏性较强，而对革兰氏阴性菌作用很弱。溶菌酶作为非特异性免疫因子，本身是一种天然蛋白质，既不会使病原菌产生耐药性，也不会使动物产生残留问题，是一种安全性很高的饲料酶制剂。三角帆蚌俗称河蚌、珍珠蚌、淡水珍珠蚌、三角蚌，学名Hyriopsiscumingii。淡水双壳类软体动物，属双壳纲、蚌科、帆蚌属。广泛分布于湖南、湖北、安徽、江苏、浙江、江西等省，尤以我国洞庭湖以及中型湖泊分布较多。壳大而扁平，壳面黑色或棕褐色，厚而坚硬，长近20厘米，后背缘向上伸出一帆状后翼，使蚌形呈三角状。后背脊有数条由结节突起组成的斜行粗肋。珍珠层厚，光泽强。铰合部发达，左壳有2枚不等大的拟主齿和2枚侧齿，右壳有2枚拟主齿和1枚侧齿。三角帆蚌是我国特有的河蚌资源，又是育珠的好材料。用它育成的珍珠质量好，80个～120个蚌可育成无核珍珠500克，还可育有核珍珠、彩色珠、夜明珠等粒大晶莹夺目的名贵珍珠。肉可食；肉及壳粉可作家畜、家禽的饲料。迄今为止，尚未有关于利用三角帆蚌基因开发重组溶菌酶及其抗菌活性的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种来源于三角帆蚌基因的重组溶菌酶，具有较宽的pH值耐受范围，且对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均具有抑菌效果，具有广泛的应用前景。为进一步研究新型绿色药物提供了参考和理论依据，同时为抗菌治疗提供高效、低毒、不易产生耐药性的药物，为开发具有自主知识产权的饲料添加剂奠定基础。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种来源于三角帆蚌基因的重组溶菌酶，所述重组溶菌酶的编码序列为SEQIDNo.1所示核苷酸序列。一种来源于三角帆蚌基因的重组溶菌酶，所述重组溶菌酶的氨基酸序列为SEQIDNo.2所示。一种来源于三角帆蚌基因的重组溶菌酶的制备方法，包括以下步骤：(1)从三角帆蚌组织中提取样品总RNA；(2)以提取的样品总RNA为模板进行逆转录获得cDNA文库；(3)以的cDNA文库为模板进行PCR扩增获得PCR扩增产物；(4)PCR扩增产物用EcoRI和XhoⅠ酶切，然后与经同样酶酶切的pEQ-30表达载体相连接形成重组质粒；(5)将重组质粒转化至大肠杆菌BL21DE3中，培养后筛选获得重组菌；(6)重组菌经IPTG诱导表达，然后进行离子交换柱层析，洗脱，收集洗脱液，洗脱液采用分子筛离心脱盐，获得重组溶菌酶。本专利技术通过优化表达条件，大量获得纯化的重组溶菌酶，并对其进行酶活性检测，探讨pH值、温度、金属离子、抑制剂或去污剂等因素对酶活性的影响。同时对重组溶菌酶的pH值耐受、温度耐受、抑菌种类也进行了探究。本专利技术的开展将有助于绿色环保药剂的应用，为进一步研究新型绿色药物提供了参考和理论依据，同时为抗菌治疗提供高效、低毒、不易产生耐药性的药物，为开发具有自主知识产权的饲料添加剂奠定基础。步骤(3)中PCR扩增采用的引物如下：正向引物：5’-AGGAATTCATGGCTGCATCTTCAAAC-3’，反向引物：5’-ACCCTCGAGATCAGCCAAGTTTCTTATTCTC-3’。步骤(3)中PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸60秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。步骤(5)中将重组质粒转化至大肠杆菌BL21DE3中采用热击法。步骤(6)中IPTG诱导表达的参数为：IPTG浓度0.1mM/L，摇床转速200-220rpm，37℃培养4h。本专利技术的有益效果是：具有较宽的pH值耐受范围，且对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均具有抑菌效果，对革兰氏阳性菌的抑菌效果更明显，具有广泛的应用前景。本专利技术为进一步研究新型绿色药物提供了参考和理论依据，同时为抗菌治疗提供高效、低毒、不易产生耐药性的药物，为开发具有自主知识产权的饲料添加剂奠定基础。附图说明图1是本专利技术的重组溶菌酶纯化后的SDS-PAGE检测结果图。M表示蛋白Marker；1表示未添加诱导剂IPTG的菌液；2表示添加IPTG诱导表达后的菌液；3表示重组蛋白(重组溶菌酶)一、4表示重组蛋白二、5表示重组蛋白三、6表示重组蛋白六。图2是BCA蛋白定量分析标准曲线图。图3是pH对酶活性的影响。图4是温度对酶活性的影响。图5是酶的pH稳定性。图6是酶的热稳定性。图7是抑制剂或去污剂对是重组溶菌酶活性的影响。图8是重组溶菌酶对subiilis和E.coli的抑菌圈大小。图9是重组溶菌酶对不同菌的抑制效果。图中：relativeactivity相对活性，temperature温度，time时间。具体实施方式下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。本专利技术中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。试剂：蛋白胨、酵母提取物购自百思生物科技有限公司，1.5MTris-HClpH8.8、1MTris-HClpH6.8、TEMED、卡那霉素购自碧云天生物技术研究所，IPTG、Tris-base、甘氨酸、SDS、30％Arc-Bis、Ni-IDAResin购自杭州诺杨生物技术有限公司，咪唑购自北京索莱宝科技有限公司，TritonX-100购自阿拉丁实业有限公司，ProteinMarker、SDS-PAGE上洋缓冲液、G-250蛋白快速染色试剂、BCA蛋白定量试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，过硫酸铵、氯化钙、氯化镁、氯化锂、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠购自天津市科密欧化学试剂有限公司，SDS、Tween-20购自阿拉丁实业有限公司，溶菌酶酶活测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，氯化钠购自高晶精细化工有限公司。三角帆蚌购自杭州市杨家门农贸市场。实施例：一种来源于三角帆蚌基因的重组溶菌酶的制备方法，包括以下步骤：(1)采用RNA提取试剂盒(HighPureFFPETRNAIsolationKit，罗氏本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种来源于三角帆蚌基因的重组溶菌酶，其特征在于：所述重组溶菌酶的编码序列为SEQ ID No.1所示核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种来源于三角帆蚌基因的重组溶菌酶，其特征在于：所述重组溶菌酶的编码序列为SEQIDNo.1所示核苷酸序列。2.一种来源于三角帆蚌基因的重组溶菌酶，其特征在于：所述重组溶菌酶的氨基酸序列为SEQIDNo.2所示。3.一种如权利要求1或2所述的来源于三角帆蚌基因的重组溶菌酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从三角帆蚌组织中提取样品总RNA；(2)以提取的样品总RNA为模板进行逆转录获得cDNA文库；(3)以的cDNA文库为模板进行PCR扩增获得PCR扩增产物；(4)PCR扩增产物用EcoRI和XhoⅠ酶切，然后与经同样酶酶切的pEQ-30表达载体相连接形成重组质粒；(5)将重组质粒转化至大肠杆菌BL21DE3中，培养后筛选获得重组菌；(6)重组菌经IPTG诱导表达，然后进行离子交换柱层析，洗脱，收集洗脱液，洗脱液采用分子筛离...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶婷，任乾，胡怡琦，李西亚，赵雪芹，费辉，任小元，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33