一种海洋红酵母来源的环氧化物水解酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种海洋红酵母来源的环氧化物水解酶及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种来源于海洋红酵母R.paludigenum的环氧化物水解酶基因(rpeh1)及对应的氨基酸序列；构建了含有该基因的重组质粒pET28a(+)‑rpeh1和基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)‑rpeh1，并利用该菌株制备重组环氧化物水解酶；应用本发明专利技术构建的基因工程菌进行生物催化，制备得到对映纯的R型苯基乙二醇ee>73％。

An Epoxide Hydrolase from Marine Rhodotorula and Its Application

The invention discloses an epoxide hydrolase from marine red yeast and its application, which belongs to the field of biotechnology. The present invention provides a epoxide hydrolase gene (rpeh1) from Rhodotorula paludigenum and its corresponding amino acid sequence; constructs a recombinant plasmid pET28a(+)rpeh1 containing the gene and a genetic engineering bacterium E.coli BL21 (DE3)/pET28a(+)rpeh1, and uses the strain to prepare the recombinant epoxide hydrolase; and uses the genetic engineering bacterium constructed by the present invention for biocatalysis. The enantiomeric purity of R-phenyl ethylene glycol EE was more than 73%.

【技术实现步骤摘要】
一种海洋红酵母来源的环氧化物水解酶及其应用
本专利技术涉及一种海洋红酵母来源的环氧化物水解酶及其应用，属于生物工程

技术介绍
手性环氧化物或邻二醇是一类高附加值的多功能合成子，可用于药物、精细化学品、农药和功能性材料等的合成。环氧化物水解酶(epoxidehydrolases，EHs)能催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分或对映归一性水解，保留单一构型环氧化物或转化为手性邻二醇。目前报道了约40种对映选择性高的EHs(对映选择率E值>30),主要用于环氧化物的水解动力学拆分，但理论产率仅为50％。与水解拆分不同，对映归一性水解的理论产率可与水解拆分不同，对映归一性水解的理论产率可达100％。对映归一性水解制备手性邻二醇有三种途径:(1)对映和区域选择性高且互补的两种EHs联合催化。Lin等将源自Streptomycesglobisporus和Streptomycescarzinostaticus的两种EHs共催化外消旋环氧苯乙烷(SO)归一性水解，(R)-苯乙二醇(PED)的产率和纯度分别为87％和99％e.e.p。(2)生物酶法和化学酸法串联催化.Orru等利用Nocardiasp.胞内对映和区域选择性高的EH攻击一种对映体中取代基少的β-碳原子，构型保留；再用硫酸催化残留的另一种对映体水解，攻击发生在取代基多的α-碳原子上，构型反转。(3)区域选择性高且互补的单一EH催化。Kotik等利用表达最优AnEH突变酶H∶12-A1的E.coli全细胞催化(R,S)-SO对映归一性水解，(R)-PED的纯度为70.1％e.e.p。一些具有环氧化物水解酶活性的菌种，如鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)，红球菌(Rhodococcussp.)，黑曲霉(Aspergillusniger)等先后被分离。Liu等将黑曲霉的环氧化物水解酶基因导入大肠杆菌中表达并获得成功，该酶以对硝基氧化苯乙烯为底物，酶活力达到104.5U/mg。Furstoss等发现A.niger(LCP521)和Beauveriabassiana(ATCC7159)产生的酶有很高的立体选择性，并且酶的区域选择性相反。随着生物信息学的发展、基因序列信息的积累以及基因工程技术的进步，快速获得新的EH基因已成为可能，且来源于真菌A.niger和细菌AgrobacteriumradiobacterADI的EH分子的微观结构已通过x-射线分析，为EH的基因工程研究提供了条件。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种海洋红酵母(Rhodosporidiumpaludigenum)来源的环氧化物水解酶、环氧化物水解酶工程菌的构建以及重组环氧化物水解酶的异源表达方法。本专利技术发现了来源于Rhodosporidiumpaludigenum的一种新型环氧化物水解酶，命名为RpEH1，其相应的基因命名为Rpeh1。RpEH1具有较高的催化活性和手性选择性，有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值。本专利技术的第一个目的是提供一种(Rhodosporidiumpaludigenum)来源的环氧化物水解酶，环氧化物水解酶是(a)、(b)或(c)：(a)含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有环氧化物水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质；(c)与(a)限定的氨基酸序列具有>97％同源性且具有环氧化物水解酶活性的蛋白质。本专利技术的第二个目的是提供编码所述环氧化物水解酶的基因。本专利技术的第三个目的是提供携带所述基因的载体或表达所述环氧化物水解酶的细胞。本专利技术的第四个目的是提供一种产环氧化物水解酶的基因工程菌，本专利技术的第五个目的是提供所述基因工程菌的构建方法：将SEQIDNO.2所示的基因与载体pET-28a(+)连接，E.coliBL21(DE3)中表达。本专利技术的第六个目的是提供一种制备R-苯乙二醇的方法，所述方法是以所述基因工程菌为细胞催化剂，以外消旋环氧苯乙烷为底物，在20～40℃下进行催化反应。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是以0.05～0.1U/mM环氧苯乙烷的比例加入细胞催化剂，于25～28度，200～220rpm反应。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是10mg/ml的菌浓催化400mM外消旋环氧苯乙烷，于25度，220rpm下反应6小时。本专利技术还要求保护所述环氧化物水解酶在手性生物催化方面的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种R.paludigenum来源的新的环氧化物水解酶，命名为RpEH1，其相应的基因命名为Rpeh1。RPEH1具有较高的催化活性和手性选择性，以外消旋环氧苯乙烷为底物时，冷冻干燥的全细胞菌体催化活性达3.7U/mg,以10mg/ml的较低冷冻全细胞浓度可以在6个小时内完成高浓度外消旋环氧苯乙烷(400mM)的归一性水解，eep达到67％，转化率为100％有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值。并且RpEH1的底物谱广泛对于4-氯氧化苯乙烯、3-氯氧化苯乙烯、苯基缩水甘油醚、对甲基缩水甘油醚、间甲基缩水甘油醚、邻甲基甲基缩水甘油醚和脂肪族环氧化物都具有较高的对映选择性和催化活性。附图说明图1：重组质粒pET-28a(+)-Rpeh1的构建示意图。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围。重组RpEH1的活性测定方法：在1.5mL的EP管中加入100μL冻干菌粉重悬液(菌体浓度10mg/ml以50mMpH7.2的磷酸盐缓冲液重悬)和800μL磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)，25℃预热2min；加入100μL200mM的环氧苯乙烷(styreneoxide，SO)并立即计时，准确反应30min后，取200μL反应液加入800μL乙酸乙酯中混匀，10000r/min离心5min后，取上层于新的EP管中，加入适量无水MgSO4，进行手性气相色谱分析(检测方法参考公开号为CN106047834A的专利申请)。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟消耗1μmol外消旋环氧苯乙烷所需的酶量定义为1个环氧化物水解酶活性单位(U)。实施例1RPEH1成熟肽cDNA序列的克隆(1)根据同源性高的海洋红酵母(Rhodosporidiumpaludigenum)CBS6565环氧化物水解酶基因序列，设计一对特异性引物，引物序列如下：RpEH1-F：5’-CATATGGCTGCCCATTCCTTTACTGC-3’，含NdeI酶切位点RpEH1-R：5’-GAATTCTCAGGCCTGGTTCGACAGCAA-3’，含EcoRI酶切位点提取筛选获得的R.paludigenum的总RNA，按照TaKaRaRNAPCRKit(Ver.3.0)使用说明书进行RT-PCR。以OligodT-AdaptorPrimer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链。以RpEH1-F和M13PrimerM4为引物进行第一轮PCR扩增，PCR条件为：94℃5min；94℃30s，51℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。以RpEH1-F和RpEH1-R为引物进行第二轮PCR扩增，PCR条件为：9本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海洋红酵母(Rhodosporidium paludigenum)来源的环氧化物水解酶，其特征在于，环氧化物水解酶是(a)、(b)或(c)：(a)含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有环氧化物水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质；(c)与(a)限定的氨基酸序列具有>97％同源性且具有环氧化物水解酶活性的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种海洋红酵母(Rhodosporidiumpaludigenum)来源的环氧化物水解酶，其特征在于，环氧化物水解酶是(a)、(b)或(c)：(a)含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有环氧化物水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质；(c)与(a)限定的氨基酸序列具有>97％同源性且具有环氧化物水解酶活性的蛋白质。2.编码权利要求1所述环氧化物水解酶的基因。3.表达权利要求1所述环氧化物水解酶的细胞或携带权利要求2所述基因的载体。4.一种基因工程菌，其特征在于，在细菌或真菌细胞中...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐雄峰，王婷婷，苏永君，章程，胡博淳，胡蝶，李剑芳，邬敏辰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32