长江三角洲白山羊毛囊干细胞分离培养方法技术

本发明专利技术提供了长江三角洲白山羊毛囊干细胞分离培养方法，采用该方法分离细胞系生长分裂状态良好且可以获得较纯的毛囊干细胞，呈现典型的铺路石状，原代细胞生长速度较快，第三天就可以观察到细胞出现聚集性生长，第四天就可以看到较多呈现聚集性生长的细胞团块，第五天就可以长满培养皿的60%‑70%，且毛囊干细胞标记物阳性率达到90%以上。经细胞染色体分析、毛囊干细胞标记物检测，以及细胞活力检测等结果表明，所构建的长江三角洲白山羊毛囊干细胞系活力旺盛、毛囊干细胞标记物阳性率高，可为研究皮肤细胞基因表达与通路调控，皮肤附属结构的生长与分化机制，尤其是皮肤主要细胞间的相互作用机制研究提供良好的实用模型。

Isolation and Culture of Hair follicle Stem Cells from White Goats in the Yangtze River Delta

The present invention provides a method for isolating and culturing hair follicle stem cells from white goats in the Yangtze River Delta. By using this method, hair follicle stem cells with good growth and division state can be separated and purified, showing typical paving stone shape. The growth rate of primary cells is faster. Aggregation growth of cells can be observed on the third day, and more aggregation growth can be observed on the fourth day. On the fifth day, 60% to 70% of the culture dishes could be filled, and the positive rate of hair follicle stem cell markers was more than 90%. The results of cell chromosome analysis, hair follicle stem cell marker detection and cell viability test showed that the constructed white goat hair follicle stem cell line in the Yangtze River Delta was vigorous and had a high positive rate of hair follicle stem cell marker. It could be used to study gene expression and pathway regulation of skin cells, growth and differentiation mechanism of skin accessory structure, especially the interaction between major skin cells. The study of action mechanism provides a good practical model.

【技术实现步骤摘要】
长江三角洲白山羊毛囊干细胞分离培养方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种长江三角洲白山羊（海门山羊）毛囊干细胞分离培养方法。
技术介绍
毛囊干细胞广泛的存在于皮肤毛囊结构中，属于成体干细胞，是毛囊中的原始细胞，具有多向分化潜能，能通过自身的分裂增殖产生机体所需的细胞，相比于胚胎干细胞及其他种类的成体干细胞，具有来源广泛、易培养与扩增、高度多能性等特点。随着干细胞研究的不断深入，毛囊干细胞研究已成为国内外学者研究的热点。毛囊干细胞位于毛囊隆突部，对毛发周期的维持、组织维持和更新、皮肤损伤修复等密切相关。毛囊干细胞与毛囊周期状态密切相关，包括生长期、退化期和休止期。毛囊周期并不是固定不变的，在受到外界刺激如皮肤损伤或者剪毛等，毛囊干细胞发生募集，促进皮肤修复和毛发生成。毛囊是控制毛发周期性生长的重要结构，但是毛囊干细胞存在部位隐蔽，体外分离和培养仍有很大的困难。目前主要的分离方法有机械分离法和酶消化法。单纯机械解离法是将毛干连同毛囊从皮肤组织中拔出，经1×PBS润洗后，把毛囊部分贴附于培养瓶或培养板中，待贴附牢固后加入含血清培养液，置于37℃，5%CO2条件下进行原代培养。酶消化解离法是将皮肤组织块经1×PBS润洗后浸入温胰蛋白酶中进行消化处理后加入含血清培养液，置于37℃，5%CO2条件下进行原代培养。以上两种方法虽然均能获得毛囊干细胞细胞，但仍存在组织块贴附不牢、细胞因酶消化和机械分离而损伤等不足，且经多次传代后较多细胞出现异常二倍体核型，以致丧失其生物学特性。目前国内外关于山羊毛囊干细胞的研究报道相对较少，大多集中在细毛羊和绒山羊。长江三角洲白山羊是唯一能生产三类笔料毛的山羊，长江三角洲白山羊毛囊干细胞的研究对于我国长江三角洲白山羊产业发展具有重要的意义，不仅可为长江三角洲白山羊羊毛生长调节机制、毛囊生长规律等研究奠定坚实的理论基础，而且可为羊毛品质、产量和质量的提高提供重要的理论和技术支持。因此，研发出一种江三角洲白山羊毛囊干细胞的制备方法，对于羊毛生长调节机制、毛囊生长规律等研究有着重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种长江三角洲白山羊（海门山羊）毛囊干细胞分离培养方法，用于解决现有技术中，毛囊干细胞的制备方法中存在不足和技术缺陷，在短时间内获得较纯的毛囊干细胞。本专利技术的技术方案如下：长江三角洲白山羊毛囊干细胞的分离培养方法，首先是皮肤组织样品的选择，本专利技术中所用的样品来源于海门山羊，选取120天胎龄左右的胎羊，采集颈背部皮肤冲洗消毒后带回实验室；用手术刀切成2mm大小的组织块，放入胰蛋白酶中，在37℃饱和湿度的培养箱中消化90min；随即拿出并更换含10%胎牛血清的培养液，并在体视显微镜下用外科神经镊挑取毛囊；把收集到的毛囊组织再次放入0.25%胰蛋白酶中37℃消化30min后，用手持匀浆器匀浆30s过200目细胞筛，37℃饱和湿度培养，每隔3天换液观察细胞生长情况；待原代毛囊干细胞生长至汇合60%-70%时，进行传代培养，采用该方法分离细胞系生长分裂状态良好且可以获得较为较纯的毛囊干细胞，毛囊干细胞标记物阳性率达到90%以上。建立长江三角洲白山羊毛囊干细胞的过程如下：（1）样本采集于江苏省国营海门市种羊场，选取120天胎龄（羊妊娠期正常时间是146到157天，平均下来是150天，这里就是还没有生产的山羊。）的胎羊颈背部的皮肤，先用手术刀刮干净表面的羊毛，用酒精消毒，再用手术刀割下2cm×2cm大小的完好皮肤组织样，用生理盐水洗净，75%（体积浓度）酒精消毒30s后再次用加入5%双抗（是指青链霉素占青链霉素混合液的体积比为5%）的生理盐水冲洗3次并放入无血清培养液，于冰盒中带回实验室，在12h内进行分离培养；（2）将步骤（1）中采集的皮肤组织样经75%（体积浓度）酒精浸泡30s，1×PBS（即0.01mol/LPBS）冲洗干净，放入培养皿中，在超净台中用手术刀片将组织块切割成2mm×2mm大小，放入培养皿中，加入0.25%胰蛋白酶使之没组织块，37℃饱和湿度消化90min；（3）当步骤（2）消化后的组织块用含10%胎牛血清的培养液（说明书中的培养液均是指含10%胎牛血清、bFGF10ng/ml、EGF10ng/ml、IGF-110ng/ml、1%双抗、I型鼠尾胶原1%的DMEM/F12培养液，10%胎牛血清是指每100ml培养液含有10ml胎牛血清）替换0.25%胰蛋白酶，至于保温板上，温度调至37℃，在体视显微镜下用外科神经镊从组织块中拔出毛囊，并置于培养液中；（4）当步骤（3）所收集到的毛囊足够多（即肉眼可见有大米粒大小的团块）的时候1200r/min离心去上清，加入0.25%胰蛋白酶37℃消化30min（要把离心后的培养液尽量吸取干净，否则培养液中的胎牛血清会影响消化效果），1200r/min离心去上清，加入培养液，用匀浆器匀浆，过200目细胞筛，置于37℃、5%（体积浓度）CO2、饱和湿度培养箱进行培养，每三天换液（培养液）并观察生长状况；（5）当步骤（4）中所的原代细胞生长至汇合60%-70%状态后，1×PBS冲洗细胞1次，加入0.25%胰蛋白酶至刚好没过培养皿表面，37℃消化2min，肉眼观察到培养皿表面出现大量白色漂浮物，显微镜下看到大块游离的细胞团块，用移液器吹打，1200r/min离心去上清，按照1.0×106个/ml的浓度于培养瓶中培养，每3天更换培养液；（6）选择对数生长期细胞，37℃消化2min，1200r/min离心后，加入10ml1×PBS制成细胞悬液，1200r/min离心弃上清，然后加入细胞冻存液并调整至1.0×106个/ml，分装入无菌冻存管中，封口，标记。将冻存管置于冻存盒放入超低温冰箱24h后移入液氮中长期保存细胞。复苏细胞时，用37℃温水快速解冻细胞，并与9倍体积的细胞培养液混合孵育10min后离心收集细胞，按5×105个/mL的细胞密度接种于培养瓶；所述的冻存培养液为含10%（体积浓度）DMSO和90%（体积浓度）FBS。本专利技术的有益效果如下：(1)本专利技术利用机械法和与酶消化相结合的方法，成功启动了长江三角洲白山羊毛囊干细胞的原代培养，成功建立了长江三角洲白山羊毛囊干细胞系。(2)本专利技术利用0.25%胰蛋白酶在37℃条件下消化处理皮肤组织，能够使得皮肤组织块当中的毛囊容易的被拔出，避免了机械法获得毛囊干细细胞时间较长和酶消化法对于细胞特性的破坏等缺点。(3)采用该方法分离细胞系生长分裂状态良好且可以获得较纯的毛囊干细胞，呈现典型的铺路石状，原代细胞生长速度较快，第三天在显微镜下就可以观察到细胞出现聚集性生长（如图1中a、b所示），第四天就可以在显微镜下看到较多呈现聚集性生长的细胞团块（如图1中c、d所示），第五天就可以长满培养皿的60%-70%（如图1中e、f所示），且毛囊干细胞标记物阳性率达到90%以上。(4)经上述细胞染色体分析、毛囊干细胞标记物检测，以及细胞活力检测等结果表明，所构建的长江三角洲白山羊毛囊干细胞系活力旺盛、毛囊干细胞标记物阳性率高，可为研究皮肤细胞基因表达与通路调控，皮肤附属结构的生长与分化机制，尤其是皮肤主要细胞间的相互作用机制研究提供良好的实用模型。附图说明图1中：a、b是体外本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种长江三角洲白山羊毛囊干细胞分离培养方法，其特征是，包括以下步骤：1）样本采集于海门山羊，选取120胎龄的胎羊，采集其颈背部皮肤冲洗消毒后带回实验室；2）将步骤1）中的样本切成2mm×2mm的组织块，放入胰蛋白酶中，在37℃饱和湿度的培养箱中消化90min；3）随即拿出并更换含10%胎牛血清的培养液，并在体视显微镜下用外科神经镊挑取毛囊；4）把收集到的毛囊组织再次放入0.25%胰蛋白酶中37℃消化30min后，用匀浆器匀浆，过200目细胞筛，37℃饱和湿度培养，每隔3天换液观察细胞生长情况；5）待原代毛囊干细胞生长至汇合60%‑70%时，进行传代培养。

【技术特征摘要】
1.一种长江三角洲白山羊毛囊干细胞分离培养方法，其特征是，包括以下步骤：1）样本采集于海门山羊，选取120胎龄的胎羊，采集其颈背部皮肤冲洗消毒后带回实验室；2）将步骤1）中的样本切成2mm×2mm的组织块，放入胰蛋白酶中，在37℃饱和湿度的培养箱中消化90min；3）随即拿出并更换含10%胎牛血清的培养液，并在体视显微镜下用外科神经镊挑取毛囊；4）把收集到的毛囊组织再次放入0.25%胰蛋白酶中37℃消化30min后，用匀浆器匀浆，过200目细胞筛，37℃饱和湿度培养，每隔3天换液观察细胞生长情况；5）待原代毛囊干细胞生长至汇合60%-70%时，进行传代培养。2.根据权利要求1所述的长江三角洲白山羊毛囊干细胞分离培养方法，其特征是，步骤1)中，样本采集于江苏省国营海门市种羊场，选取120天胎龄的胎羊颈背部的皮肤，先用手术刀刮干净表面的羊毛，用酒精消毒，再用手术刀割下2cm×2cm的完好皮肤组织样，用生理盐水洗净，75%酒精消毒30s后再次用加入5%双抗的生理盐水冲洗3次并放入无血清培养液，于冰盒中带回实验室，在12h内进行分离培养；根据权利要求2所述的长江三角洲白山羊毛囊干细胞分离培养方法，其特征是，步骤2)中，将步骤1)中采集的皮肤组织样经75%酒精浸泡30s，1×PBS冲洗干净，放入培养皿中，在超净台中用手术刀片将皮肤组织样切割成2mm×2mm，放入培养皿中，加入0.25%胰蛋白酶使之没皮肤组织样，37℃饱和湿度消化90min；根据权利要求3所述的长江三角洲白山羊毛囊干细胞分离培养方法，其特征是，步骤3)中，步骤2)消化后的皮肤组织样用含10%胎牛血清的培养液替换0.25%胰蛋白酶，置于保温板上，温度调至37℃，在体视显微...

【专利技术属性】
技术研发人员：李拥军，王强，尹修远，瞿静雯，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32