聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物及其合成方法和应用技术

本发明专利技术公开了聚L‑肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物及其合成方法和应用。聚L‑肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物的结构如式(Ⅰ)所示；本发明专利技术还提供了聚L‑肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物的合成方法，该合成方法简单，原料成本较低，反应用到的试剂和合成的产物无毒无污染；各步反应的反应条件温和，易于操作，且反应副产物少，可广泛应用于科学研究及生产。

Poly L-Carnosine Aminoethyl Methacrylamide Polymer and Its Synthetic Method and Application

The invention discloses a polyL carnosine aminoethyl methacrylamide polymer and a synthesis method and application thereof. The structure of poly L carnosine aminoethyl methacrylamide polymer is shown in formula (I); the present invention also provides a synthetic method of poly L carnosine aminoethyl methacrylamide polymer, which is simple, low cost of raw materials, non-toxic and non-polluting reagents used in the reaction and products synthesized; the reaction conditions of each step are mild, easy to operate, and the reaction by-products are few and can be widely used. It is widely used in scientific research and production.

【技术实现步骤摘要】
聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物及其合成方法和应用
本专利技术属于有机及高分子聚合物合成领域，尤其涉及聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物及其合成方法和应用。
技术介绍
1900年俄国化学家古列维奇首次从肉类中提取得到肌肽，1918年Barger等人首次确定肌肽的化学结构组成为β-丙氨酰-L-组氨酸，即由β-丙氨酸和L-组氨酸组成的二肽(β-alanyl-L-histidine)。肌肽被证明是一种内源性二肽，肌肉组织和脑组织中均含有高浓度的肌肽(20mM)。除了从肌肉组织中人工提取肌肽，有关肌肽的化学合成和生物合成也有很多报道。最早的化学合成肌肽的方法是Baumann等人为了证实从牛肉中提取出来的肌肽的化学结构的假想而报道的，组氨酸与β碘代丙酰氯反应后再氨解得到肌肽。Cherevin等人于2007年报道了由三氟乙酸化的β-丙氨酸和组氨酸反应合成肌肽的方法，避免了引起产物的外消旋。酶合成策略作为肌肽化学合成的替代方法可以克服化学合成法的不足，如缺乏反应特异性、有机溶剂使用和官能团的保护和活化等。由β-丙氨酸和L-组氨酸在肌肽合成酶的催化下合成肌肽是最常见的酶合成方法。Heck等人报道了利用细菌性β-氨肽酶催化水溶液酶反应系统合成肌肽。肌肽分子结构含中有三个可电离的基团，羧基pKa＝2.75，β-丙氨酸中伯胺pKa＝9.3，咪唑环上的氨基pKa＝6.75。肌肽本身具有较强的缓冲能力，且肌肽水溶性极好，而难溶于常见的大多数有机溶剂。大量的研究表明肌肽具有多种生物学特性，如修复肝损伤、保护中枢神经系统、和调节酶活性等。进一步的研究表明肌肽有助于保护生物膜免受脂质过氧化而带来的损伤和清除活性氧(ROS)的功能。有关肌肽的抗氧化性已有比较深入的研究，现在普遍认为肌肽的抗氧化性主要体现在三个方面：与金属离子螯合、具有超氧化物歧化酶类似活性、清除ROS和其它自由基的能力。肌肽因独特的生理活性在病理学、医学、营养学和运动学等领域已被大量研究，近年来，肌肽在化学和生物交叉领域的研究报道也越来越多，但基于L-肌肽的均聚物或共聚物合成研究还未见报道，使肌肽的生物应用范围受到严重限制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物及其合成方法和应用，该聚L-肌肽甲基丙烯酰胺聚合物具有低毒性，可用于细胞转染。本专利技术所述一种聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物，结构如式(Ⅰ)所示：其中数均聚合度n＝17～19。进一步，数均聚合度n＝17，数均分子量Mn.GPC＝7.6kDa，分子量分布PDI≈1.2，聚合物重复单元分子量Mm＝436。本专利技术提供了一种聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物(PCar)的合成方法，是以L-肌肽为起始原料，采用常用的二碳酸二叔丁酯作为氨基保护剂合成双Boc肌肽，接着利用N-羟基琥珀酰亚胺活化双Boc肌肽分子结构中的羧基得到双Boc肌肽活性酯；与此同时，将甲基丙烯酰氯与N-羟基琥珀酰亚胺进行反应制得甲基丙烯活性酯，再与过量乙二胺反应得到氨乙基甲基丙烯酰胺，随后将双Boc肌肽活性酯与氨乙基甲基丙烯酰胺进行反应得到双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺，最终通过传统自由基聚合方法，以偶氮二异丁腈作为自由基引发剂引发双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺自由基聚合，聚合反应产物经无水乙醚多次沉淀纯化后由酸脱除Boc即得到聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物。具体包括：(1)以二碳酸二叔丁酯作为氨基保护试剂保护L-肌肽分子结构中的咪唑氨基和伯胺，得双Boc肌肽；(2)所述双Boc肌肽与N-羟基琥珀酰亚胺在脱水剂条件下反应生成双Boc肌肽活性酯；(3)甲基丙烯酰氯与N-羟基琥珀酰亚胺反应生成甲基丙烯活性酯，三乙胺作为碱吸收反应生成的HCl；(4)所述甲基丙烯活性酯与乙二胺反应生成氨乙基甲基丙烯酰胺；(5)所述双Boc肌肽活性酯和氨乙基甲基丙烯酰胺反应生成双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺；(6)采用自由基聚合方法，以偶氮二异丁腈作为自由基引发剂引发所述双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺自由基聚合；(7)采用酸脱除聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物分子结构中的Boc，得聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物。步骤(1)中，L-肌肽与二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:2～1:4，优选为1:3；反应溶剂由1,4-二氧六环与水按体积比3～4:1组成；反应温度为4～25℃，反应时间为12～24h；反应在pH8～9条件下进行，可用饱和NaHCO3溶液提供碱性环境。步骤(2)中，脱水剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；双Boc肌肽、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1:1～1:1.5:2，优选为1:1.1:1.5；反应在有机溶剂中进行，有机溶剂为二氯甲烷等；反应温度为4～25℃，反应时间为8～12h。步骤(3)中，甲基丙烯酰氯、N-羟基琥珀酰亚胺和三乙胺的摩尔比为1:1:1～1:1.5:2，优选为1:1.1:1.1；反应在有机溶剂中进行，有机溶剂为二氯甲烷等；反应温度为4～25℃，反应时间为8～12h。步骤(4)中，甲基丙烯活性酯与乙二胺的摩尔比为1:10～1:20，优选为1:15；反应在有机溶剂中进行，有机溶剂为四氢呋喃等；反应温度为4～25℃，反应时间为8～12h。步骤(5)中，双Boc肌肽活性酯与氨乙基甲基丙烯酰胺的摩尔比为1:1～1:1.2，优选为1:1；反应在有机溶剂中进行，有机溶剂为四氢呋喃等；反应温度为20～25℃，反应时间为6～12h。步骤(6)中，双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺与偶氮二异丁腈摩尔比为18:1～20:1；双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺在体系中的浓度为0.48～0.52mol/L，优选为0.5mol/L；反应在有机溶剂中进行，有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺等；反应温度为73～77℃，优选为75℃，反应时间为20～24h。步骤(7)中，酸为三氟乙酸。本专利技术还提供了所述的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物在作为外源DNA运输载体中的应用。本专利技术的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物具有良好的缓冲能力，能与DNA形成稳定的纳米复合物，毒性小，可作为DNA运输载体。本专利技术还提供了所述的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物在体外细胞转染中的应用。其中，体外细胞转染时N/P＝5～30，优选为10～30，进一步优选为20～30。有益效果：本专利技术的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物的毒性很低，可作为外源DNA的运输载体，用于细胞转染研究。本专利技术的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物合成方法简单，原料成本较低，反应用到的试剂和合成的产物无毒无污染；各步反应的反应条件温和，易于操作，且反应副产物少，可广泛应用于科学研究及生产。附图说明图1为双Boc肌肽核磁共振氢谱图(溶剂为氘代氯仿)；图2为双Boc肌肽核磁共振碳谱图(溶剂为氘代氯仿)；图3为双Boc肌肽高分辨质谱图；图4为双Boc肌肽活性酯核磁共振氢谱图(溶剂为氘代氯仿)；图5为双Boc肌肽活性酯核磁共振碳谱图(溶剂为氘代氯仿)；图6为双Boc肌肽活性酯高分辨质谱图；图7为甲基丙烯活性酯核磁共振氢谱图(溶剂为氘代氯仿)；图8为氨乙基甲基丙烯酰胺核磁共振氢谱图(溶剂为氘代氯仿)；图9为双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚L‑肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物，其特征在于，结构如式(Ⅰ)所示：

【技术特征摘要】
1.一种聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物，其特征在于，结构如式(Ⅰ)所示：其中数均聚合度n＝17～19。2.根据权利要求1所述的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物，其特征在于，n＝17。3.根据权利要求1或2所述的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物的合成方法，其特征在于，包括：(1)以二碳酸二叔丁酯作为氨基保护试剂保护L-肌肽分子结构中的咪唑氨基和伯胺，得双Boc肌肽；(2)所述双Boc肌肽与N-羟基琥珀酰亚胺在脱水剂条件下反应生成双Boc肌肽活性酯；(3)甲基丙烯酰氯与N-羟基琥珀酰亚胺反应生成甲基丙烯活性酯，三乙胺作为碱吸收反应生成的HCl；(4)所述甲基丙烯活性酯与乙二胺反应生成氨乙基甲基丙烯酰胺；(5)所述双Boc肌肽活性酯和氨乙基甲基丙烯酰胺反应生成双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺；(6)采用自由基聚合方法，以偶氮二异丁腈作为自由基引发剂引发所述双Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺自由基聚合；(7)采用酸脱除聚Boc肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物分子结构中的Boc，得聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物。4.根据权利要求2所述的聚L-肌肽氨乙基甲基丙烯酰胺聚合物的合成方法，其特征在于，步骤(1)中，L-肌肽与二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:2～1:4；反应温度为4～25℃，反应时间为12～24h；反应在pH8～9条件下进行；步骤(2)中，脱水剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；双Boc肌肽、N-羟基琥珀酰亚胺和脱水剂的摩尔比为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯福德，曹磊磊，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32