一种靶向多功能纳米粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种靶向多功能纳米粒及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域，采用超声双乳化法制备靶向多功能纳米粒，利用支化PEI与PLGA进行共价结合，将原本带负电荷的PLGA纳米粒修饰为携带正电荷的阳离子纳米粒，能够有效的吸附质粒，在循环系统中保证质粒不会因为物理作用而脱落，进入细胞后被胞内酶降解的机率也降低。该纳米粒中还含有IR780，能够靶向于肿瘤细胞线粒体，同时，IR780的强荧光和光敏剂特性使纳米粒成为一个很好的荧光和光声成像介质，方便观察肿瘤。该纳米粒中可以载药，以便联合转基因治疗，不但更有利于消灭肿瘤细胞，还能减少化疗药物的毒副作用。该靶向多功能纳米粒制备方法简单，易操作，适合扩大化生产。

A Targeted Multifunctional Nanoparticles and Its Preparation and Application

The invention relates to a targeted multifunctional nanoparticle and its preparation method and application, belonging to the field of biomedical technology. Targeted multifunctional nanoparticles are prepared by ultrasonic double emulsification method. The branched PEI is covalently combined with PLGA to modify the original negatively charged PLGA nanoparticles into cationic nanoparticles with positive charges, which can effectively adsorb plasmids and ensure in the circulating system. Plasmids do not fall off because of physical action, and the possibility of degradation by intracellular enzymes is also reduced after entering cells. The nanoparticles also contain IR780, which can target the mitochondria of cancer cells. At the same time, the strong fluorescence and photosensitizer characteristics of IR780 make the nanoparticles become a good fluorescence and photoacoustic imaging medium for easy observation of tumors. The nanoparticles can be loaded with drugs in order to combine with genetically modified therapy, which is not only more conducive to the elimination of cancer cells, but also can reduce the toxicity and side effects of chemotherapy drugs. The preparation method of the targeted multifunctional nanoparticles is simple, easy to operate and suitable for expanded production.

【技术实现步骤摘要】
一种靶向多功能纳米粒及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种靶向多功能纳米粒及其制备方法和应用。
技术介绍
小动物基因转染多数采用尾静脉直接注射质粒，但这种方法没有转染部位的特异性和精准性，以及存在注射后的质粒不能很好的进入细胞，且易被降解，转染效率低等缺陷，因而不适用于肿瘤的基因治疗。以纳米粒作为载体，由于肿瘤的EPR效应，纳米粒本身就有一种在肿瘤部位聚集吞噬的趋势，并且常用作药物缓释载体，因此可以将质粒包载到纳米粒中内水相里面，但是目前将质粒包载于纳米粒中内水相里面还存在两个弊端，一个是包载的过程中，合成纳米粒需要用到声震仪，这对于质粒是一种破环，使其出现开环的情况；其次，包载于内水相的质粒进入细胞后，其释放效率相比于吸附于表面而言会低很多。因此，急需一种释放效率高、靶向性好的多功能纳米粒。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种靶向多功能纳米粒的制备方法；目的之二在于提供一种靶向多功能纳米粒；目的之三在于提供靶向多功能纳米粒在制备肿瘤基因治疗药物中的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、一种靶向多功能纳米粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)将分子量为7000-12000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和七甲川花菁类荧光小分子IR780溶于二氯甲烷中，然后加入内水相，冰浴条件下超声处理，再加入聚乙烯醇水溶液，再次超声后加入异丙醇水溶液，获得混合液Ⅰ，搅拌所述混合液Ⅰ2.5-3.5h后去除所述二氯甲烷，最后离心获得沉淀Ⅰ，将所述沉淀Ⅰ洗涤后以MES缓冲液重悬获得重悬液，将所述重悬液放置于4-8℃下，备用；所述混合液Ⅰ中聚乳酸-羟基乙酸共聚物、七甲川花菁类荧光小分子IR780、内水相、聚乙烯醇和异丙醇的质量体积比为50:0.5-3:0.025-0.3:80-240:0.04-0.2，所述质量体积比的单位为mg:mg:mL:mg:mL；(2)将N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于MES缓冲液中，然后加入步骤(1)中获得的重悬液中，获得混合液Ⅱ，搅拌所述混合液Ⅱ2-2.5h，所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与步骤(1)中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为15-25:60-75:50；(3)将分子量≤25000的支化聚乙烯亚胺溶于MES缓冲液中，然后加入经步骤(2)处理后的混合液Ⅱ中，获得混合液Ⅲ，搅拌所述混合液Ⅲ2-2.5h后进行稀释，最后离心获得沉淀Ⅱ，将所述沉淀Ⅱ洗涤后冷冻干燥，即可；所述支化聚乙烯亚胺与步骤(1)中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为40-50:1。优选地，步骤(1)中，所述内水相为水、化疗药物的水溶液或相变材料中的一种。优选地，所述水为双蒸水；所述化疗药物的水溶液为盐酸多柔比星水溶液或硫酸长春新碱水溶液中的一种；所述相变材料为全氟正戊烷或全氟己烷中的一种。优选地，步骤(1)中，两次超声的条件为：超声功率为135w，超声频率为20kHz，每间隔5s超声一次，每次超声时间为5s，共超声14-17次。优选地，步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中，所述搅拌的速度为40-100r/min。优选地，步骤(1)和步骤(3)中，所述离心的速度为10000-11500r/min，离心的时间为5-8min。优选地，步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中，所述MES缓冲液的浓度为0.1M，pH值为5-6。优选地，步骤(1)中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物和MES缓冲液的质量体积比50:0.8；步骤(2)中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和MES缓冲液的质量体积比60:0.8；步骤(3)中，所述支化聚乙烯亚胺和MES缓冲液的质量体积比2:8；所述质量体积比的单位均为mg:mL。2、由所述的方法制备的靶向多功能纳米粒。3、所述靶向多功能纳米粒在制备肿瘤基因治疗药物中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种靶向多功能纳米粒及其制备方法和应用，采用超声双乳化法制备靶向多功能纳米粒，利用支化聚乙烯亚胺与聚乳酸-羟基乙酸共聚物进行共价结合，将原本带负电荷的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒修饰为携带正电荷的阳离子纳米粒，能够有效的吸附质粒，在循环系统中保证质粒不会因为物理作用而脱落，进入细胞后被胞内酶降解的机率也降低。该纳米粒中还含有七甲川花菁类荧光小分子IR780，能够靶向于肿瘤细胞线粒体，可以更加精准的将纳米粒导入肿瘤细胞内，减少非靶向部位的转染带来的副作用，同时，IR780的强荧光和光敏剂特性使纳米粒成为一个很好的荧光和光声成像介质，方便观察肿瘤。加之，并专利技术在制备该靶向多功能纳米粒的过程中，通过限定各原料的用量，可以实现在保证最终制备的纳米粒的粒径及产品得率的同时，减少原料的浪费。另外，本专利技术中纳米粒中可以载药，以便联合转基因治疗，起到一个协同效应，不但有利于消灭肿瘤细胞，还减少了化疗药物的用量，进而减少化疗药物的毒副作用。本专利技术中靶向多功能纳米粒制备方法简单，易操作，适合扩大化生产。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为实施例1中制备的靶向多功能纳米粒的扫描电镜图；图2为实施例1中制备的靶向多功能纳米粒的透射电镜图；图3为实施例1中制备的靶向多功能纳米粒的zeta电位测试图；图4为实施例1中制备的靶向多功能纳米粒对质粒的吸附能力测试结果图；(a为质粒的激光扫描图，b为靶向多功能纳米粒的激光扫描图，c为吸附了质粒的靶向多功能纳米粒的激光扫描图)图5为实施例1中制备的靶向多功能纳米粒对质粒的吸附量测试结果图；图6为实施例1中制备的靶向多功能纳米粒对癌细胞的靶向作用测试结果图；图7为实施例1中制备的靶向多功能纳米粒介导的基因表达情况测试结果图；图8为LIFU对实施例1中制备的靶向多功能纳米粒与转基因的增效作用测试结果荧光图；图9为LIFU对实施例1中制备的靶向多功能纳米粒与转基因的增效作用测试结果柱状图；图10为经实施例1中制备的靶向多功能纳米粒转染基因后的肿瘤细胞培养过程中划痕变化图；图11为经实施例1中制备的靶向多功能纳米粒转染基因后的肿瘤细胞的迁移能力测试结果图。具体实施方式下面将对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例1制备靶向多功能纳米粒(1)将50mg分子量为12000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和2mg七甲川花菁类荧光小分子IR780溶于1mL二氯甲烷中，然后加入200uL浓度为15g/L的盐酸多柔比溶液，在超声功率为135w、超声频率为20Hz，冰浴条件下利用声震仪超声处理，处理时每间隔5s超声一次，每次超声时间为5s，共超声16次，再加入4mL浓度为40g/L的聚乙烯醇水溶液，再次在超声功率为135w、超声频率为20Hz条件下利用声震仪超声处理，处理时每间隔5s超声一次，每次超声时间为5s，共超声16次后加入6mL体积分数为2％的异丙醇水溶液，获得混合液Ⅰ，以60r/min的速度搅拌该混合液Ⅰ3h后去除二氯甲烷，最后以10500r/min的速度离心6min，获得沉淀Ⅰ，用浓度为0.1M，pH值为5.1的MES缓冲液将该沉淀Ⅰ洗涤两次，每次洗涤完后均以10500r/min的速度离心6mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向多功能纳米粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将分子量为7000‑12000的聚乳酸‑羟基乙酸共聚物和七甲川花菁类荧光小分子IR780溶于二氯甲烷中，然后加入内水相，冰浴条件下超声处理，再加入聚乙烯醇水溶液，再次超声后加入异丙醇水溶液，获得混合液Ⅰ，搅拌所述混合液Ⅰ2.5‑3.5h后去除所述二氯甲烷，最后离心获得沉淀Ⅰ，将所述沉淀Ⅰ洗涤后以MES缓冲液重悬获得重悬液，将所述重悬液放置于4‑8℃下，备用；所述混合液Ⅰ中聚乳酸‑羟基乙酸共聚物、七甲川花菁类荧光小分子IR780、内水相、聚乙烯醇和异丙醇的质量体积比为50:0.5‑3:0.025‑0.3:80‑240:0.04‑0.2，所述质量体积比的单位为mg:mg:mL:mg:mL；(2)将N‑羟基硫代琥珀酰亚胺和1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐溶于MES缓冲液中，然后加入步骤(1)中获得的重悬液中，获得混合液Ⅱ，搅拌所述混合液Ⅱ2‑2.5h，所述N‑羟基硫代琥珀酰亚胺和1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐与步骤(1)中聚乳酸‑羟基乙酸共聚物的质量比为15‑25:60‑75:50；(3)将分子量≤25000的支化聚乙烯亚胺溶于MES缓冲液中，然后加入经步骤(2)处理后的混合液Ⅱ中，获得混合液Ⅲ，搅拌所述混合液Ⅲ2‑2.5h后进行稀释，最后离心获得沉淀Ⅱ，将所述沉淀Ⅱ洗涤后冷冻干燥，即可；所述支化聚乙烯亚胺与步骤(1)中聚乳酸‑羟基乙酸共聚物的质量比为40‑50:1。...

【技术特征摘要】
1.一种靶向多功能纳米粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将分子量为7000-12000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和七甲川花菁类荧光小分子IR780溶于二氯甲烷中，然后加入内水相，冰浴条件下超声处理，再加入聚乙烯醇水溶液，再次超声后加入异丙醇水溶液，获得混合液Ⅰ，搅拌所述混合液Ⅰ2.5-3.5h后去除所述二氯甲烷，最后离心获得沉淀Ⅰ，将所述沉淀Ⅰ洗涤后以MES缓冲液重悬获得重悬液，将所述重悬液放置于4-8℃下，备用；所述混合液Ⅰ中聚乳酸-羟基乙酸共聚物、七甲川花菁类荧光小分子IR780、内水相、聚乙烯醇和异丙醇的质量体积比为50:0.5-3:0.025-0.3:80-240:0.04-0.2，所述质量体积比的单位为mg:mg:mL:mg:mL；(2)将N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于MES缓冲液中，然后加入步骤(1)中获得的重悬液中，获得混合液Ⅱ，搅拌所述混合液Ⅱ2-2.5h，所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与步骤(1)中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为15-25:60-75:50；(3)将分子量≤25000的支化聚乙烯亚胺溶于MES缓冲液中，然后加入经步骤(2)处理后的混合液Ⅱ中，获得混合液Ⅲ，搅拌所述混合液Ⅲ2-2.5h后进行稀释，最后离心获得沉淀Ⅱ，将所述沉淀Ⅱ洗涤后冷冻干燥，即可；所述支化聚乙烯亚胺与步骤(1)中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为40-50:1。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝兰，王梦竹，王志刚，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50