一种鉴定激酶体外特异性磷酸化氨基酸位点的方法技术

本发明专利技术提供了一种鉴定激酶体外特异性磷酸化氨基酸位点的方法，该方法包括以下步骤：(1)令待测磷酸化位点的底物蛋白或肽段进行体外激酶反应；(2)在步骤(1)反应结束后将反应产物冰浴后进行LC‑MS/MS质谱检测与纯化和分析。与现有技术相比，本发明专利技术方法具有鉴定底物磷酸化位点多、鉴定效率高、检测分析周期较短、费用低廉、准确性高等特点，克服了现有技术的不足，对鉴定激酶体外特异性磷酸化氨基酸位点具有明显效能，相比于已有鉴定方法具备多方面优势，是研究蛋白质翻译后磷酸化修饰的有力工具。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定激酶体外特异性磷酸化氨基酸位点的方法
本专利技术属于基础医学领域，涉及鉴定蛋白氨基酸位点的方法，具体涉及鉴定激酶体外特异性磷酸化底物蛋白氨基酸位点的方法，更具体地，涉及一种体外激酶反应产物利用串联质谱检测肽段磷酸化修饰氨基酸位点的新方法。
技术介绍
蛋白质翻译后修饰是指蛋白质在翻译中或翻译后经历的一个共价加工过程，即通过一个或几个氨基酸残基加上修饰基团或通过蛋白质水解剪去基团而改变蛋白质的性质。蛋白质翻译后修饰主要包含磷酸化、泛素化、乙酰化、糖基化、甲基化、琥珀酰化等，其中磷酸化修饰作为真核生物蛋白质修饰中最常见的修饰之一，已被证实参与机体内几乎所有的生物学过程，除了作为细胞信号转导的核心调控方式外，同时参与细胞的增殖分裂、迁移、代谢与死亡等。在基础医学研究领域，癌症、免疫相关性疾病与神经退行性疾病等众多疾病的发病机理均有蛋白磷酸化修饰异常的参与。尽管蛋白磷酸化修饰已被研究多年，但关于磷酸化氨基酸位点的鉴定方法依然停留在传统的生物化学实验验证。目前国际与国内主要运用磷酸化抗体验证特异性氨基酸位点，简而言之，针对底物蛋白某一磷酸化位点制备特异性磷酸化抗体后运用免疫印迹的方法检测体外激酶反应产物中的底物蛋白磷酸化水平，该方法在以往的蛋白质磷酸化修饰研究中被广泛运用，同时在推动该领域的探索发展过程中至关重要，但该方法同时存在下列不足：(a)鉴定底物磷酸化位点单一，特异性磷酸化抗体仅能识别单个蛋白某一个位点的磷酸化修饰；本专利涉及的方法可识别几十个，几百个，甚至几千个磷酸化修饰位点，具备广谱性特征。(b)鉴定效率较低，生物体内一个蛋白往往有多个磷酸化位点，因此研究某一个底物蛋白磷酸化位点需要多个特异性磷酸化抗体，同时也需要多次免疫印迹实验验证；本专利涉及的方法可通过单次质谱鉴定几十个，几百个，甚至几千个磷酸化修饰位点，鉴定结果不受磷酸化位点个数影响，鉴定效率极高。(c)鉴定周期较长及费用较高，一般制备一支特异性磷酸化抗体周期需要2个月左右，费用约5000元；本专利涉及的质谱检测与分析周期较短，一般在1周以内，单次费用一般不超过1500元，甚至更为低廉。(d)鉴定结果是否阳性的判断标准较为模糊，以特异性磷酸化抗体为基础的免疫印迹技术主要采用酶促化学底物发光原理进行检测，结果是否阳性的判断标准为发光的强弱，当发光较弱时难以界定阳性或阴性。本专利涉及的质谱鉴定结果分析是以磷酸基团修饰的荷质比变化为依据判断是否阳性，相比于传统免疫学方法更具科学性与准确性，仅仅单个底物或肽段的单个位点磷酸化修饰即可被鉴定。基于以上所述，如何建立高效可靠并低廉稳定的激酶体外特异性磷酸化氨基酸位点的新方法是当前重要的关键科学问题之一。
技术实现思路
本专利技术的任务是提供一种鉴定激酶体外特异性磷酸化氨基酸位点的方法，使其具有鉴定底物磷酸化位点多、鉴定效率高、检测分析周期较短、费用低廉、准确性高等特点，以克服现有技术的不足。实现本专利技术的技术方案是：本专利技术提供的鉴定激酶体外特异性磷酸化氨基酸位点的方法，包括以下步骤：(1)令待测磷酸化位点的底物蛋白或肽段进行体外激酶反应；(2)在步骤(1)反应结束后将反应产物冰浴后进行LC-MS/MS质谱检测与纯化和分析。上述步骤(1)所述的令待测磷酸化位点的底物蛋白或肽段进行体外激酶反应的具体方法是：在EP管中加入激酶反应缓冲液、令待测磷酸化位点的底物蛋白或肽段、激酶和ATP，然后将EP管置于预先加热至30℃的恒温水浴锅中水浴10～60min，优选为30min。底物蛋白或肽段、激酶和ATP三种物质的加入量可以为：1～5μg底物蛋白或肽段、1～10ng激酶及20μM的ATP；所述的激酶可以是：细胞周期素依赖蛋白激酶5(Cyclin—dependentKinase5，缩写CDK5)、蛋白激酶C(ProteinkinaseC，PKC)或死亡相关蛋激酶1(Death-associatedproteinkinase1，DAPK1)等。上述步骤(2)中所述的进行LC-MS/MS质谱检测与纯化和分析的具体方法是：首先，对激酶反应产物进行溶液内酶解；其次，选择毛细管高效液相色谱方法进行纯化然后，使用ESI质谱进行数据采集；最后进行质谱数据分析。所述的对激酶反应产物进行溶液内酶解的具体方法是：吸取激酶反应产物10～100μg，优选范围20～40μg，进一步优选30μg，加入30μLSTDbuffer，沸水浴5～10min，冷却至室温；加入200μLUAbuffer(8MUrea，150mMTris-HClpH8.5)混匀，转入30kDa超滤管离心；加入200μLUAbuffer离心，弃滤液，加入100μLIAA(50mMIAAinUA)，振荡1～3min，避光室温孵育30～60min，离心，加入100μLUAbuffer，离心，重复2～4次；加入100μL25mMNH4HCO3，离心，重复2～4次；加入40μL25mMNH4HCO3同时加入Trypsin，酶切过夜后离心；再加入40μL25nMNH4HCO3，离心，酸化，得到酶解后的激酶反应产物。所述的选择毛细管高效液相色谱方法进行纯化的具体方法是：A液为0.1％甲酸的水溶液，B液为0.1％甲酸的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈所占体积比为84％；色谱柱以95％的A液平衡后，酶解后的激酶反应产物由自动进样器上样至Trap柱，色谱梯度：0-50min，B液线性梯度从4％到50％；50min-54min，B液线性梯度从50％到100％；54min-60min，B液维持在100％，得到经纯化的酶解后的激酶反应产物，即多肽和多肽碎片。所述的使用ESI质谱进行数据采集的具体方法是：将经纯化的酶解后的激酶反应产物，即多肽和多肽碎片的质量电荷比按照每次全扫描(fullscan)后采集10个碎片图谱(MS2scan)方法采集。所述的进行质谱数据分析的具体方法是：质谱测试原始文件(rawfile)用Mascot2.2软件检索数据库，得到磷酸化氨基酸位点的鉴定结果，所述的数据库选择和设定为：Database选择待测磷酸化位点的底物蛋白或肽段氨基酸序列作为自建库，Taxonomy选择自建库，Enzyme选择Trypsin，Dynamicalmodifications选择Oxidation(M)；Phospho(STY)，Fixedmodifications选择Carbamidomethyl(C)，MaxMissedCleavages选择2，ProteomicsTools选择3.1.6，设定Filterbyscore>＝20。上述步骤(2)中所述的LC-MS/MS质谱检测的具体条件可以是：检测仪器选择型号Qexactive(ThermoFinnigan,SanJose,CA)，进样方式选择Nanospray，毛细管温度200℃，检测方式为正离子，Trap柱选择ThermoscientificEASYcolumn上样柱(2cm×100μm5μm-C18)，分析柱为ThermoscientificEASYcolumn(75μm×100mm3μm-C18)。与现有技术存在的鉴定底物磷酸化位点单一、特异性磷酸化抗体仅能识别单个蛋白某一个位点的磷酸化修饰的不足相比较。本专利技术提供的方法具有长本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定激酶体外特异性磷酸化氨基酸位点的方法，包括以下步骤：(1)令待测磷酸化位点的底物蛋白或肽段进行体外激酶反应；(2)在步骤(1)反应结束后将反应产物冰浴后进行LC‑MS/MS质谱检测与纯化和分析。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定激酶体外特异性磷酸化氨基酸位点的方法，包括以下步骤：(1)令待测磷酸化位点的底物蛋白或肽段进行体外激酶反应；(2)在步骤(1)反应结束后将反应产物冰浴后进行LC-MS/MS质谱检测与纯化和分析。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的令待测磷酸化位点的底物蛋白或肽段进行体外激酶反应的具体方法是：在EP管中加入激酶反应缓冲液、令待测磷酸化位点的底物蛋白或肽段、激酶和ATP，然后将EP管置于预先加热至30℃的恒温水浴锅中水浴10～60min，优选为30min。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，底物蛋白或肽段、激酶和ATP三种物质的加入量为：1～5μg底物蛋白或肽段、1～10ng激酶及20μM的ATP。4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述的激酶是：细胞周期素依赖蛋白激酶5、蛋白激酶C或死亡相关蛋激酶1。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的进行LC-MS/MS质谱检测与纯化和分析的具体方法是：首先，对激酶反应产物进行溶液内酶解；其次，选择毛细管高效液相色谱方法进行纯化然后，使用ESI质谱进行数据采集；最后进行质谱数据分析。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的对激酶反应产物进行溶液内酶解的具体方法是：吸取激酶反应产物10～100μg，优选范围20～40μg，进一步优选30μg，加入30μLSTDbuffer，沸水浴5～10min，冷却至室温；加入200μLUAbuffer，混匀，转入30kDa超滤管离心；加入200μLUAbuffer，离心，弃滤液，加入100μLIAA，振荡1～3min，避光室温孵育30～60min，离心，加入100μLUAbuffer，离心，重复2～4次；加入100μL25mMNH4HCO3，离心，重复2～4次；加入40μL25mMNH4HCO3同时加入Trypsin，酶切过夜后离心；再加入40μL25nMNH4HCO3，离心，酸化，得到酶解后的激酶反应产物。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的选择毛细管高效液相色谱...

【专利技术属性】
技术研发人员：田波，张培，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42