一种同时检测葛根中11种黄酮类成分的方法技术

一种同时检测葛根中11种黄酮类成分的方法，属于药物分析技术领域。采用超高液相色谱‑质谱联用法(HPLC‑MS)建立葛根的多指标含量测定方法，同时测定葛根素、3'‑羟基葛根素、3'‑甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、刺芒柄花苷、刺芒柄花黄素、异甘草素、鹰嘴豆芽素A 11种黄酮类成分的含量，以弥补现有技术的不足，促进对葛根黄酮类物质成分的了解及其含量测定，为其广泛应用提供科学依据。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测葛根中11种黄酮类成分的方法
本专利技术属于化学物检测领域。本专利技术涉及农产品中黄酮类成分的检测方法，主要是葛根中11种黄酮类成分的检测方法。技术背景葛根为豆科葛属植物野葛[Puerarialobata(Willd.)Ohwi]的干燥根，习称野葛，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻之功，用于外感发热头痛、项背强痛、消渴等症状，主产于河南、浙江、四川等地，是一种药食同源的植物，具有较好的市场前景。近年来，研究发现葛根生物活性成分中黄酮类物质含量最高。黄酮类物质是小分子化合物，广泛存在于许多中草药中，有较好的抗氧化性和清除自由基的能力。其中异黄酮是葛根的主要化学成分，包括3'-羟基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元等，并且葛根素是葛属植物特有的活性成分。现代药理研究表明，该类化合物在维持血管系统稳定性方面有特效，是其降低血管阻力、改善心脑血液循环、减慢心率、降低心肌耗氧量等药理作用的主要物质，临床常用于心脑血管疾病的辅助治疗。此外，基于其具有抗氧化损伤、抗细胞凋亡、改善血脂和血糖代谢等功能，在骨质疏松、酒精中毒及经前期综合征等疾患的治疗中也取得了一定进展。
技术实现思路
本专利技术的目的是为进一步加深葛根活性成分的深入研究，采用超高液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)建立葛根的多指标含量测定方法，同时测定葛根素、3'-羟基葛根素、3'-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、刺芒柄花苷、刺芒柄花黄素、异甘草素、鹰嘴豆芽素A11种黄酮类成分的含量，以弥补现有技术的不足，促进对葛根黄酮类物质成分的了解及其含量测定，为其广泛应用提供科学依据。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供同时检测葛根中葛根素、3'-羟基葛根素、3'-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、刺芒柄花苷、刺芒柄花黄素、异甘草素、鹰嘴豆芽素A的方法，它包括如下操作步骤：(1)取葛根样品干燥粉末，以质量百分比浓度为30％乙醇(分析纯)超声提取45min，于室温下放冷，7500r/m离心5min，取上清，每0.5g葛根样品干燥粉末对应50ml30％乙醇，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液用质量百分比浓度为10％甲醇(色谱纯)稀释1000倍，为制备供试品溶液；(2)选择葛根素、3'-羟基葛根素、3'-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、刺芒柄花苷、刺芒柄花黄素、异甘草素、鹰嘴豆芽素A为对照品，制备对照品混合溶液；准确称定11种对照品适量，用甲醇溶解后，加入10％甲醇定量稀释，制成每1mL分别含葛根素22.93μg、3'-羟基葛根素35ug、3'-甲氧基葛根素6.47ug、大豆苷236ug、大豆苷元10ug、染料木素9ug、染料木苷332.22ug、刺芒柄花苷450ug、刺芒柄花黄素4.73ug、异甘草素8.53ug、鹰嘴豆芽素A9.8ug的溶液作为对照品混合储备液。保存于4℃冰箱中，备用；取对照品混合储备液适量，用10％甲醇逐级稀释，并定量稀释制成每1mL分别含葛根素229.3ng、3'-羟基葛根素350ng、3'-甲氧基葛根素64.7ng、大豆苷2360ng、大豆苷元100ng、染料木素90ng、染料木苷3322.2ng、刺芒柄花苷4500ng、刺芒柄花黄素47.3ng、异甘草素85.3ng、鹰嘴豆芽素A98ng的溶液；保存于4℃冰箱中，备用；取对照品储备液适量，加10％甲醇逐级稀释，得到对照品混合溶液；(3)将稀释的对照品混合溶液在超高效液相色谱-质谱仪中进行进样分析，得到关于11种物质专属性-样品图谱，分别将逐级稀释的对照品混合溶液在相同色谱和质谱条件下的超高效液相色谱-质谱仪中进行进样分析，得到11种物质检测值和浓度的线性关系；(4)将步骤(1)制备的供试品溶液采用与步骤(3)相同的色谱和质谱条件下的超高效液相色谱-质谱仪中进行进样分析，根据步骤(3)中的专属性-样品图谱、检测值和浓度的线性关系，得到11种物质的浓度，进一步计算含量。检测葛根中上述11种成分，仪器条件如下：色谱条件：色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC182.5μm(2.1×100mm)；流速：0.2mL·min-1；柱温：40℃；进样量：10L；流动相：A：甲醇；B：0.1wt％甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0min：10％A，6min：90％A，8min：90％A，9min：10％A，10min：10％A；质谱条件：离子源：电喷雾离子化源(ESI源)；离子极性：正离子(Positive)；扫描方式：全扫描；扫描范围(m/z)：100-800；分辨率：70000；鞘气流速：35arb；辅助气流速：10arb；吹扫气流速：0arb；电离电压：4KV(+)；离子传输管温度：350℃；辅助气加热温度：250℃；AGCtarget：1e6；最大注入时间：50ms；11种黄酮标品检测所得的定量离子数见表1。表111种黄酮标品检测所得的定量离子数本专利技术的优点：由于这11种黄酮类成分中存在两对同分异构体，即葛根素-大豆苷、3'-羟基葛根素-染料木苷，所以在分析过程中，实现各物质基线分离和目标物含量测定是难点。本专利技术所建立的方法可同时分离测定葛根素、3'-羟基葛根素、3'-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、刺芒柄花苷、刺芒柄花黄素、异甘草素、鹰嘴豆芽素A11种成分。目前公开的色谱-质谱条件均不能实现同时对本专利技术中的11种成分进行含量测定。本专利技术检测方法中，出峰数量较多，分离度良好，基线平稳，能够对葛根中主要黄酮类成分进行有效检测，为其深入研究提供可靠检测手段。本专利技术首次在同一色谱条件下检测了上述葛根中的主要黄酮类成分，并指认了11个具体化合物，可更全面的用于葛根中黄酮类活性成分的深入研究。附图说明图1为实施例中11种黄酮的专属性-样品图谱；图2为实施例中11种黄酮的专属性-标品图谱；图3为实施例中11种黄酮的进样精密度图谱；图4为实施例中11种黄酮的线性标准曲线图谱；图5为实施例中11种黄酮的重复性图谱；图6为实施例中11种黄酮的稳定性图谱；图7为实施例中11种黄酮的加标回收50％图谱；图中：a.葛根素；b.3’-羟基葛根素；c.3’-甲氧基葛根素；d.大豆苷；e.大豆苷元；f.染料木素；g.染料木苷；h.刺芒柄花苷；i.刺芒柄花黄素；j.异甘草素；k.鹰嘴豆芽素A具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术并不限于以下实施例。实施例1：本专利技术检测方法包括如下步骤：(1)取葛根样品干燥粉末，以30％乙醇(分析纯)超声提取45min，，于室温下放冷，7500r/m离心5min，取上清，定容，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液用10％甲醇(色谱纯)稀释1000倍，为制备供试品溶液；(2)选择葛根素、3'-羟基葛根素、3'-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、刺芒柄花苷、刺芒柄花黄素、异甘草素、鹰嘴豆芽素A为对照品，制备对照品溶液；(3)分别将对照品、供试品溶液在同一色谱和质谱条件下的超高效液相色谱-质谱仪中进行进样分析，检测葛根中上述11种成分即可，仪器条件如下：色谱条件：色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC182.5μm(2.1×100mm)；流速：0.2mL·min-1；柱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测葛根中11种黄酮类成分的方法，其特征在于，同时检测葛根中葛根素、3'‑羟基葛根素、3'‑甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、刺芒柄花苷、刺芒柄花黄素、异甘草素、鹰嘴豆芽素A的方法，它包括如下操作步骤：(1)取葛根样品干燥粉末，以质量百分比浓度为30％乙醇(分析纯)超声提取45min，于室温下放冷，7500r/m离心5min，取上清，每0.5g葛根样品干燥粉末对应50ml 30％乙醇，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液用质量百分比浓度为10％甲醇(色谱纯)稀释1000倍，为制备供试品溶液；(2)选择葛根素、3'‑羟基葛根素、3'‑甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、刺芒柄花苷、刺芒柄花黄素、异甘草素、鹰嘴豆芽素A为对照品，制备对照品混合溶液；准确称定11种对照品适量，用甲醇溶解后，加入10％甲醇定量稀释，制成每1mL分别含葛根素22.93μg、3'‑羟基葛根素35ug、3'‑甲氧基葛根素6.47ug、大豆苷236ug、大豆苷元10ug、染料木素9ug、染料木苷332.22ug、刺芒柄花苷450ug、刺芒柄花黄素4.73ug、异甘草素8.53ug、鹰嘴豆芽素A9.8ug的溶液作为对照品混合储备液。保存于4℃冰箱中，备用；取对照品混合储备液适量，用10％甲醇逐级稀释，并定量稀释制成每1mL分别含葛根素229.3ng、3'‑羟基葛根素350ng、3'‑甲氧基葛根素64.7ng、大豆苷2360ng、大豆苷元100ng、染料木素90ng、染料木苷3322.2ng、刺芒柄花苷4500ng、刺芒柄花黄素47.3ng、异甘草素85.3ng、鹰嘴豆芽素A 98ng的溶液；保存于4℃冰箱中，备用；取对照品储备液适量，加10％甲醇逐级稀释，得到对照品混合溶液；(3)将稀释的对照品混合溶液在超高效液相色谱‑质谱仪中进行进样分析，得到关于11种物质专属性‑样品图谱，分别将逐级稀释的对照品混合溶液在相同色谱和质谱条件下的超高效液相色谱‑质谱仪中进行进样分析，得到11种物质检测值和浓度的线性关系；(4)将步骤(1)制备的供试品溶液采用与步骤(3)相同的色谱和质谱条件下的超高效液相色谱‑质谱仪中进行进样分析，根据步骤(3)中的专属性‑样品图谱、检测值和浓度的线性关系，得到11种物质的浓度，进一步计算含量；检测葛根中上述11种成分，仪器条件如下：色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 2.5μm(2.1×100mm)；流速：0.2mL·min‑1；柱温：40℃；进样量：10L；流动相：A：甲醇；B：0.1wt％甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0min：10％A，6min：90％A，8min：90％A，9min：10％A，10min：10％A；质谱条件：离子源：电喷雾离子化源(ESI源)；离子极性：正离子(Positive)；扫描方式：全扫描；扫描范围(m/z)：100‑800；分辨率：70000；鞘气流速：35arb；辅助气流速：10arb；吹扫气流速：0arb；电离电压：4KV(+)；离子传输管温度：350℃；辅助气加热温度：250℃；AGC target：1e6；最大注入时间：50ms。...

【技术特征摘要】
1.一种同时检测葛根中11种黄酮类成分的方法，其特征在于，同时检测葛根中葛根素、3'-羟基葛根素、3'-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、刺芒柄花苷、刺芒柄花黄素、异甘草素、鹰嘴豆芽素A的方法，它包括如下操作步骤：(1)取葛根样品干燥粉末，以质量百分比浓度为30％乙醇(分析纯)超声提取45min，于室温下放冷，7500r/m离心5min，取上清，每0.5g葛根样品干燥粉末对应50ml30％乙醇，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液用质量百分比浓度为10％甲醇(色谱纯)稀释1000倍，为制备供试品溶液；(2)选择葛根素、3'-羟基葛根素、3'-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、刺芒柄花苷、刺芒柄花黄素、异甘草素、鹰嘴豆芽素A为对照品，制备对照品混合溶液；准确称定11种对照品适量，用甲醇溶解后，加入10％甲醇定量稀释，制成每1mL分别含葛根素22.93μg、3'-羟基葛根素35ug、3'-甲氧基葛根素6.47ug、大豆苷236ug、大豆苷元10ug、染料木素9ug、染料木苷332.22ug、刺芒柄花苷450ug、刺芒柄花黄素4.73ug、异甘草素8.53ug、鹰嘴豆芽素A9.8ug的溶液作为对照品混合储备液。保存于4℃冰箱中，备用；取对照品混合储备液适量，用10％甲醇逐级稀释，并定量稀释制成每1mL分别含葛根素229.3ng、3'-羟基葛根素350ng、3'-甲氧基葛根素64.7ng、大豆苷2360ng、大豆苷元100ng、染料木素90ng、染料木苷3322.2ng、刺芒柄花苷4500ng、刺芒柄花黄素47.3ng、异甘草素85.3n...

【专利技术属性】
技术研发人员：张芳，王雨婷，王琪，盛望，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11