本发明专利技术公开了一种第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法与应用。该方法包括如下步骤：(1)向缓冲液GA中加入18％～20％(V/V)β－巯基乙醇，然后加入浮游动物进行研磨，得到组织缓冲液；(2)向组织缓冲液中加入蛋白酶PK进行消化，然后加入RNase A，静置、离心，取上清液；再加入溶剂，离心，取上清液；最后加入缓冲液GB，混匀后加入无水乙醇，得到混合液；(3)将混合液加入到吸附柱CB3中，进行漂洗和洗脱，得到浮游动物基因组DNA。本发明专利技术的方法简单、易操作，且能够有效的去除色素，获得的浮游动物基因组DNA片段完整、纯度高、浓度高，为浮游动物特别是枝角类的第三代测序工作的顺利开展提供了保证。
【技术实现步骤摘要】
一种第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法与应用
本专利技术属于基因工程领域，特别涉及一种第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法与应用。
技术介绍
根据化石记录和DNA数据，枝角类属于一种古老的甲壳类群。它们的动物地理学特征有：部分动物区系复合体和分类群呈现两极分离分布格局；一些物种分布范围广而另外一些物种分布范围窄；在两个半球温带－亚热带地区出现隔离种群以及较集中的本地种。这些都有利于我们通过跟植物、无脊椎动物以及脊椎动物的比较来分析枝角类的动物区系形成的历史原因。因此，对枝角类某些物种进行基因组测序有利于我们开展其群体进化与功能基因分析，讨论物种在基因结构与群体的遗传结构，从而从分子层面解释物种的进化机制、环境适应、行为与抗病机制等系列问题。近年来，高通量测序技术突飞猛进，极大地推动了全基因组测序工作的展开，全球已有数百种植物和动物完成了全基因组测序工作。第三代测序技术凭借着片段读长更长的优势在基因组研究中得到广泛应用。其中基于PacBioSequel平台的单分子实时测序(SingleMoleculeReal-Time,SMRT)技术不需要扩增即可快速读取序列。虽然SMART技术具有其他技术所无法比拟的优势，但是它对样本DNA的浓度、纯度以及完整性有更高的要求。样品主要要求指标为：样品溶液澄清无色，无不可溶解物质；电泳主带清晰，轻度降解，无蛋白、多糖及小片段污染，无RNA污染；样品A260/A280在1.8～2.0之间，A260/A230在2.0～2.2之间；样品NanoDrop所测浓度与Qubit所测浓度比值≤1.5；样品DNA总量≥10μg。浮游动物目前已有的基因组仅限于第二代测序方法，例如萼花臂尾轮虫(Brachionuscalyciflorus)，大型溞(Daphniamagna)，蚤状溞(Daphniapulex)等。在用常规试剂盒提取枝角类基因组DNA的过程中，我们发现部分透明物种(如秀体溞(Diaphanosoma)，薄皮溞(Leptodora)及长棘溞(Cercopagidae))的基因组DNA溶液含有大量色素，A260/230始终偏低，无法满足下游建库的要求。此外，由于枝角类个体较小，多数种类的体长不足2mm，室内培养需要花费庞大的人力物力。因此，特别需要快速的收集方法以及高效的DNA提取方法来解决这些技术困难，满足第三代测序的要求。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法。本专利技术的另一目的在于提供所述第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，包括如下步骤：(1)向基因组DNA提取试剂盒中的缓冲液GA中加入18％～20％(V/V)β－巯基乙醇，得到细胞裂解液；然后将浮游动物加入到细胞裂解液中于冰上进行研磨，得到研磨后的组织缓冲液；(2)向步骤(1)中得到的组织缓冲液中加入蛋白酶PK，于55℃～57℃水浴条件下进行消化，待水浴完成后放置，得到混合液I；(3)向步骤(2)中得到的混合液I中加入RNaseA，混合均匀后放置，离心，取上清，得到上清液II；(4)向步骤(3)中得到的上清液II中加入溶剂，混合均匀，离心，取上清，得到上清液III；其中，溶剂为苯酚、氯仿和异戊醇混合得到的溶剂；(5)向步骤(4)中得到的上清液III中加入缓冲液GB，混合均匀，然后加入无水乙醇，混合均匀，得到混合液IV；(6)将步骤(5)中得到的混合液IV加入到吸附柱CB3中，离心，弃废液，然后将吸附柱CB3放入收集管中用漂洗液进行漂洗，最后用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，得到浮游动物基因组DNA。步骤(1)中所述的基因组DNA提取试剂盒为常规市售的动物组织基因组DNA提取试剂盒；优选为公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒。步骤(1)中所述的浮游动物为枝角类；优选为模糊秀体溞(Diaphanosomadubium)，透明薄皮溞(Leptodorarichard)及长柱尾突蚤(Bythotrepheslongimanus)。步骤(1)中所述的浮游动物优选为通过如下任一种方法收集得到：(A)使用60～120μm的拖网从水体中采集浮游动物水样，依次通过600μm和250μm的网筛，然后将250μm网筛上面的浮游动物转移到含有抗生素的水中，放置5～6小时后通过人工挑选，得到所需要的浮游动物；(B)使用120μm的拖网从水体中采集浮游动物，挑选出所需要的浮游动物个体，进行扩大培养，得到所需要的浮游动物。方法(A)适用于当所需物种丰度占绝对优势时进行的浮游动物的收集。方法(A)中所述的浮游动物为个体较大的浮游动物；包括枝角类，如模糊秀体溞(Diaphanosomadubium)等。方法(A)中所述的水为纯净水。方法(A)中所述的含有抗生素的水为含有青霉素和链霉素的水；优选为含有100u/L的青霉素和100μg/L的链霉素的水。方法(A)中所述的人工挑选优选为在白炽灯光下进行人工挑选。方法(A)中所述的挑选的次数优选为2～3次，以保证物种纯度。方法(A)中所述人工挑选得到的浮游动物保存在含有抗生素的水中；优选为保存在含有100u/L的青霉素和100μg/L的链霉素的水中。方法(B)适用于当所需物种丰度较低时进行的浮游动物的收集。方法(B)中所述的浮游动物包括枝角类。方法(B)中所述的挑选为采用塑胶吸管进行挑选。方法(B)中所述的培养所用的培养液为含有抗生素和蛋白核小球藻的培养液。所述的抗生素为青霉素和链霉素。所述的培养液中青霉素的浓度为100u/L，链霉素的浓度为100μg/L，蛋白核小球藻的浓度为2mgC/L。方法(B)中所述的培养的条件为：培养温度28℃，光周期12:12hr(hour)，培养时间3个月。步骤(1)中所述的细胞裂解液的用量为按每毫克(mg)浮游动物配比8～12μl细胞裂解液计算；优选为按每毫克浮游动物配比8μl细胞裂解液计算。步骤(2)中所述的蛋白酶PK的的浓度优选为20mg/ml。步骤(2)中所述的蛋白酶PK的添加量为按其在所述体系的终浓度为1～3mg/ml计算。步骤(2)中所述的水浴的时间为10～15min；优选为10min。所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，还包括将步骤(2)水浴过程中的混合液每隔3min颠倒混匀1次的步骤。步骤(2)中所述的放置的时间优选为5min。步骤(3)中所述的RNaseA的浓度为10mg/ml。步骤(3)中所述的RNaseA的添加量为按其在所述体系的终浓度为1～2mg/ml计算。步骤(3)中所述的放置的时间为5～8min；优选为8min。步骤(3)和(6)中所述的离心的条件为：12000rpm离心30s。步骤(4)中所述的上清液II和溶剂的体积比为1:1。步骤(4)中所述的苯酚、氯仿和异戊醇的体积比优选为25：24：1。步骤(4)中所述的离心的条件为：13500rpm离心5min。步骤(5)中所述的上清液III、缓冲液GB和无水乙醇的体积比优选为1:1:1。步骤(6)中所述的Tris-HCl缓冲液为pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液。所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法在提取浮游动物基因组DN本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)向基因组DNA提取试剂盒中的缓冲液GA中加入18％～20％(V/V)β－巯基乙醇，得到细胞裂解液；然后将浮游动物加入到细胞裂解液中于冰上进行研磨，得到研磨后的组织缓冲液；(2)向步骤(1)中得到的组织缓冲液中加入蛋白酶PK，于55℃～57℃水浴条件下进行消化，待水浴完成后放置，得到混合液I；(3)向步骤(2)中得到的混合液I中加入RNase A，混合均匀后放置，离心，取上清，得到上清液II；(4)向步骤(3)中得到的上清液II中加入溶剂，混合均匀，离心，取上清，得到上清液III；其中，溶剂为苯酚、氯仿和异戊醇混合得到的溶剂；(5)向步骤(4)中得到的上清液III中加入缓冲液GB，混合均匀，然后加入无水乙醇，混合均匀，得到混合液IV；(6)将步骤(5)中得到的混合液IV加入到吸附柱CB3中，离心，弃废液，然后将吸附柱CB3放入收集管中用漂洗液进行漂洗，最后用Tris‑HCl缓冲液进行洗脱，得到浮游动物基因组DNA。
【技术特征摘要】
1.一种第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)向基因组DNA提取试剂盒中的缓冲液GA中加入18％～20％(V/V)β－巯基乙醇，得到细胞裂解液；然后将浮游动物加入到细胞裂解液中于冰上进行研磨，得到研磨后的组织缓冲液；(2)向步骤(1)中得到的组织缓冲液中加入蛋白酶PK，于55℃～57℃水浴条件下进行消化，待水浴完成后放置，得到混合液I；(3)向步骤(2)中得到的混合液I中加入RNaseA，混合均匀后放置，离心，取上清，得到上清液II；(4)向步骤(3)中得到的上清液II中加入溶剂，混合均匀，离心，取上清，得到上清液III；其中，溶剂为苯酚、氯仿和异戊醇混合得到的溶剂；(5)向步骤(4)中得到的上清液III中加入缓冲液GB，混合均匀，然后加入无水乙醇，混合均匀，得到混合液IV；(6)将步骤(5)中得到的混合液IV加入到吸附柱CB3中，离心，弃废液，然后将吸附柱CB3放入收集管中用漂洗液进行漂洗，最后用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，得到浮游动物基因组DNA。2.根据权利要求1所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，其特征在于：步骤(1)中所述的浮游动物为枝角类；步骤(1)中所述的基因组DNA提取试剂盒为动物组织基因组DNA提取试剂盒。3.根据权利要求2所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，其特征在于：步骤(1)中所述的浮游动物为模糊秀体溞，透明薄皮溞或长柱尾突蚤；步骤(1)中所述的基因组DNA提取试剂盒为公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒。4.根据权利要求1所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，其特征在于：步骤(1)中所述的细胞裂解液的用量为按每毫克浮游动物配比8～12μl细胞裂解液计算；步骤(2)中所述的蛋白酶PK的添加量为按其在所述体系的终浓度为1～3mg/ml计算；步骤(3)中所述的RNaseA的添加量为按其在所述体系的终浓度为1～2mg/ml计算。5.根据权利要求1所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，其特征在于：步骤(4)中所述的苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1；步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩博平，刘平，徐少林，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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