利用食烷菌发酵降解石蜡生产2-氧代己二酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用食烷菌发酵降解石蜡生产2‑氧代己二酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术的技术方案要点为：利用食烷菌发酵降解石蜡生产2‑氧代己二酸的方法，所述食烷菌Alcanivoraxsp.Y5为经离子束照射诱变的变异菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018461。该方法以石蜡为唯一碳源来生产2‑氧代己二酸，不仅克服了常规生物合成方法产量低的障碍，而且成本低廉，也提高了石油工业副产品的利用率，减轻传统化学合成法对环境造成的污染。

【技术实现步骤摘要】
利用食烷菌发酵降解石蜡生产2-氧代己二酸的方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种利用食烷菌发酵降解石蜡生产2-氧代己二酸的方法。
技术介绍
2-氧代己二酸(2-Ketoadipicacid；2-Oxoadipicacid)是己二酸(Adipicacid)的前体物质。己二酸又称肥酸，能够发生成盐反应、酯化反应、酰胺化反应等，并能与二元胺或二元醇缩聚成高分子聚合物等。己二酸是工业上具有重要意义的二元羧酸，在化工生产、有机合成工业、医药、润滑剂制造、工程塑料等领域应用广泛。预计2020年，世界己二酸产能将达510万吨，居所有二元羧酸中的第二位(姬亚非.国内外己二酸市场分析[J].化工管理,2017(5):136)。目前己二酸的主要生产方式是化学合成，主要以环己酮混合物与环己醇为原料，通过化学反应合成。生产原料及中间产物毒性强，且生产过程中产生大量有害气体，对大气及河流环境污染严重。因此，己二酸的生物合成法越来越受到全世界的关注，近年来关于微生物发酵法生产己二酸的报道也越来越多。微生物发酵法生产己二酸的研究主要集中在以葡萄糖为底物，通过微生物如大肠杆菌(Escherichiacoli)发酵合成己二酸前体顺，顺-粘康酸(cis,cis-muconicacid)，然后再利用金属催化剂催化合成己二酸(ZhangHR,PereiraB,LiZJ,,etal.EngineeringEscherichiacolicoculturesystemsfortheproductionofbiochemicalproducts.PNAS2015,112(27):8266–8271)。邓禹等通过大肠杆菌配合底物乙酰CoA和琥珀酰CoA全生物合成己二酸(邓禹,张晓娟,毛银.一种己二酸的全生物合成方法:CN105112436A[P].2015.)。此外，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)发酵油脂(Coconutoil)以及不动杆菌(Acinetobacter)氧化环己醇也可以产生己二酸(BeardsleeT,PicataggioS.Bio-basedadipicacidfromrenewableoils.LipidTechnol,2012,24(10):223–225；ChengQ,ThomasSM,KostichkaK,etal.GeneticanalysisofageneclusterforcyclohexanoloxidationinAcinetobactersp.strainSE19byinvitrotransposition.JBacteriol,2000,182(17):4744–4751)。虽然目前理论上可以实现己二酸的生物合成，但由于产率低，成本高等原因，生物法生产己二酸达不到工业化的要求。截至目前为止，利用Alcanivoraxsp.液体发酵降解长链烷烃获得2-氧代己二酸的工艺尚属首例。作为己二酸的前体物质，2-氧代己二酸可以与氢气加成反应，然后再利用醇的消去反应成双键，然后再与氢气加成反应生成己二酸。也可利用黄鸣龙还原反应或者CLEMMENSEN还原反应生成己二酸，步骤简单(LiJJ.Namereactions:acollectionofdetailedreactionmechanisms[J].Springer,2014)。不同于目前的常规方法以葡萄糖等底物为原料生物合成己二酸前体物及己二酸，尝试以微生物降解长链烷烃的方式获得己二酸前体物2-氧代己二酸是一种新的思路。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供了一种利用食烷菌发酵降解石蜡生产2-氧代己二酸的方法，该方法以石蜡为唯一碳源来生产2-氧代己二酸，不仅克服了常规生物合成方法产量低的障碍，而且成本低廉，也提高了石油工业副产品的利用率，减轻传统化学合成法对环境造成的污染。本专利技术为解决上述技术问题采用如下技术方案，利用食烷菌发酵降解石蜡生产2-氧代己二酸的方法，其特征在于：所述食烷菌Alcanivoraxsp.Y5为经离子束照射诱变的变异菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018461，保藏日期为2018年7月9日，保藏单位地址为中国武汉武汉大学。本专利技术所述的利用食烷菌发酵降解石蜡生产2-氧代己二酸的方法，其特征在于具体过程为：将含有上述食烷菌Alcanivoraxsp.Y5的菌悬液按照体积百分数为5％的接种量接种于发酵培养基装液量为50mL的250mL三角瓶中，发酵培养基的配方为(NH4)2SO48.0g/L、NH4NO32.0g/L、K2HPO41.0g/L、KH2PO41.0g/L、MgSO40.2g/L、FeCl30.03g/L、CaCl20.02g/L、NaCl15.0g/L、石蜡6.0g/L、吐温80体积百分含量为0.1％，发酵培养基的初始pH为7.0，液体发酵温度控制在28℃，转速为150rpm，发酵时长为5～7d。优选的，所述菌悬液的浓度为106CFU/mL。优选的，所述石蜡为53#固体石蜡或液体石蜡中的一种或多种，其中53#固体石蜡需要切碎后加入发酵培养基灭菌使用。优选的，以液体石蜡为碳源时，Alcanivoraxsp.Y5发酵液中2-氧代己二酸的含量为3.5g/L，转化率高达58.33％。本专利技术利用生物降解途径生产己二酸的前体物2-氧代己二酸，底物成本低，工艺简单，在尼龙工程塑料等领域具有广阔的应用前景。附图说明图1为发酵液中2-氧代己二酸的LC-MS检测图谱。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本专利技术上述内容实现的技术均属于本专利技术的范围。1.实验菌株食烷菌Alcanivoraxsp.Y5(CCTCCNO：M2018461)。2.菌株的活化将保藏的食烷菌划线或者涂布在海生菌培养基2216(美国BD公司，琼脂添加量为20g/L)上，28℃培养7d。3.菌悬液的制备刮取1～2环固体培养基上的菌苔，转移至装有无菌水的灭菌EP管(离心管)中，旋涡仪混匀后，置于4℃冰箱待用。4.发酵条件将菌悬液(菌悬液浓度＝106CFU/mL)按照体积百分数为5％的接种量接种于发酵培养基装液量为50mL的250mL三角瓶中，发酵培养基的配方为(NH4)2SO48.0g/L、NH4NO32.0g/L、K2HPO41.0g/L、KH2PO41.0g/L、MgSO40.2g/L、FeCl30.03g/L、CaCl20.02g/L、NaCl15.0g/L、石蜡6.0g/L、吐温80体积百分含量为0.1％，发酵培养基的初始pH为7.0，液体发酵温度控制在28℃，转速为150rpm，发酵时长为7d。5.2-氧代己二酸的测定测定样本的制备过程如下：发酵结束，取1mL菌液于灭菌的EP管中，8000rpm低温离心10min，取上清800μL，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，低温保存待用。取100μL微生物发酵液样本，加入400μL提取液(甲醇、乙腈与水的体积比为2:2:1)，涡旋混匀30s。冰水浴超声处理10min后将样本4℃、12000rpm离心15min。小心地取出0.35mL上清于2mL甲烷硅基化的进样瓶中真空干燥。干本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用食烷菌发酵降解石蜡生产2‑氧代己二酸的方法，其特征在于：所述食烷菌Alcanivorax sp.Y5为经离子束照射诱变的变异菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018461。

【技术特征摘要】
1.利用食烷菌发酵降解石蜡生产2-氧代己二酸的方法，其特征在于：所述食烷菌Alcanivoraxsp.Y5为经离子束照射诱变的变异菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018461。2.根据权利要求1所述的利用食烷菌发酵降解石蜡生产2-氧代己二酸的方法，其特征在于具体过程为：将含有食烷菌Alcanivoraxsp.Y5的菌悬液按照体积百分数为5%的接种量接种于发酵培养基装液量为50mL的250mL三角瓶中，发酵培养基的配方为(NH4)2SO48.0g/L、NH4NO32.0g/L、K2HPO41.0g/L、KH2PO41.0g/L、MgSO40.2g/L、FeCl30.03g/L、CaCl20.02g/L、NaCl15.0g/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海磊，赵国威，鲁欣欣，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南,41