VEGFB基因的应用及VEGFB肿瘤诱导和肿瘤抑制动物模型的构建方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，提供一种VEGFB基因的应用及VEGFB肿瘤诱导和肿瘤抑制动物模型的构建方法。本发明专利技术公开了血管内皮生长因子VEGFB基因可以作为治疗多种癌症的靶基因，VEGFB过表达提供转基因小鼠癌症诱导模型，VEGFB敲除提供转基因小鼠癌症抑制模型，这两种转基因小鼠模型可以用于多种癌症致病机理的研究，也可以用于药物筛选和药效测试，更重要的是根据VEGFB敲除提供转基因小鼠癌症抑制模型对肿瘤的抑制效果和VEGFB脂肪组织过表达提供转基因小鼠癌症诱导模型促进肿瘤生长，开发针对VEGFB的抗癌药物。

【技术实现步骤摘要】
VEGFB基因的应用及VEGFB肿瘤诱导和肿瘤抑制动物模型的构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及VEGFB基因的应用及VEGFB肿瘤诱导和肿瘤抑制动物模型的构建方法。
技术介绍
恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的常见疾病，其发病率和死亡率呈上升趋势，国际癌症研究中心预测未来20年全球新增癌症病例会上升到每年2200万，癌症死亡病例将上升到每年1300万；而亚太地区的癌症负担也不断加重。目前我国恶性肿瘤的发病率为285．91/10万，平均每天每分钟有6人被诊断为恶性肿瘤，死亡率为180.54/10万，未来肿瘤将越来越成为疾病防控中的重大问题。实验动物模型可以模拟某些人类疾病，为医学研究的重要手段之一。癌症诱导动物模型和肿瘤抑制动物模型在癌症发病机理研究，药物筛选评估方面起着非常重要的作用。VEGF(血管内皮生长因子)家族包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE、PlGF(胎盘生长因子)及VEGF-F。血管内皮生长因子通过与其受体相联系而发挥各自的生物学功能。这些受体包含跨膜酪氨酸激酶受体VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3和神经纤毛蛋白受体(NRP-1和NRP-2)。VEGF家族成员在诱导血管和淋巴管的形成中起着重要的作用。Olofsson等发现了一种新的作用于内皮细胞上的生长因子，命名为VEGFB,与VEGF高度同源，在许多组织中与VEGF协调表达。VEGFB大量表达于心脏、肌肉和棕色脂肪组织等线粒体丰富的组织，其受体包括VEGFR1和NRP1。人的VEGFB基因位于11号染色体的q13臂上，长度大约4000bp。VEGFB通过可变剪接产生两个剪接突变体VEGFB167和VEGFB186。VEGFB167和VEGFB186序列不同并且分子C-末端的长度也不同。VEGFB167和VEGFB186成熟蛋白都包含相同的116个氨基酸N-末端区域。这个N-末端区域包含VEGFB受体结合区域，而且此N-末端区域与VEGFA和PlGF相应区域有着高同源性，因此预测VEGFB也可能会形成类似于VEGFA和PlGF中的半胱氨酸-二硫化物连接的同型二聚体蛋白。VEGFB167和VEGFB186的C末端区域则存在差异，使其具有不同的特性因此会影响VEGFB在体内的分布。VEGFB167含有一个C-末端肝素结合区域，能够与细胞表面相关的肝素样粘多糖相联系，因此能够在细胞外基质中锚定这种亚型。相比之下，VEGFB186不能与肝素结合，因此VEGFB186能够自由扩散。VEGFB的功能目前还不是很清楚。人们发现VEGFB在多种肿瘤中高表达，如结肠癌，乳腺癌和肾脏癌。VEGFB在肿瘤细胞中的表达及其对VEGFR1和神经黏蛋白-1的活化作用暗示其作为抗癌治疗靶标的可能性。VEGFB基因敲除小鼠没有像VEGF基因敲除那样出现胚胎致死现象，小鼠的产仔率正常，敲除鼠各项生理状态均正常，说明抑制VEGFB的表达对人体伤害较小。开发针对VEGFB的抗癌药物比VEGF抗癌药物更具有临床应用价值。因此，构建VEGFB肿瘤诱导动物模型和肿瘤抑制动物模型在癌症治疗中具有极其重要的应用价值；针对VEGFB基因开发相关的抗癌药物具有极其重要的临床应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种VEGFB基因的应用及VEGFB肿瘤诱导和肿瘤抑制动物模型的构建方法。本专利技术公开了VEGFB基因可以作为治疗癌症的靶基因，构建的VEGFB肿瘤诱导动物模型和肿瘤抑制动物模型可以用于多种癌症致病机理的研究，也可以用于药物筛选和药效测试。更有意义的是可以开发一些针对VEGFB的抗癌药物。为实现以上专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了VEGFB基因作为预防和/或治疗癌症的药物靶点的应用。本专利技术还提供了VEGFB基因的过表达在构建癌症诱导动物模型的应用。本专利技术还提供了VEGFB基因的敲除在构建肿瘤抑制动物模型的应用。本专利技术还提供了VEGFB基因的抑制剂或拮抗剂在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。本专利技术还提供了表达载体，VEGFB过表达质粒含有编码VEGFB基因的核苷酸序列；VEGFB敲除质粒含有分别位于VEGFB外显子2和外显子4上的20bp的两个sgRNA。本专利技术中VEGFB过表达质粒还含有aP2启动子,VEGFB敲除载体利用CRASPR-Cas9技术构建。利用所述的一种VEGFB过表达载体构建肿瘤诱导动物模型的方法，所述VEGFB过表达载体转入动物体内，即得肿瘤诱导动物模型，具体方法为：以小鼠心脏组织VEGFB的cDNA为模板，以aP2-pLVCT为载体，构建重组质粒pLVCT-VEGFB-186和pLVCT-VEGFB-167，限制性内切酶酶切线性化重组质粒pLVCT-VEGFB-186和pLVCT-VEGFB-167，回收6.1kb的pLVCT-VEGFB-186和pLVCT-VEGFB-167，显微注射获得肿瘤诱导小鼠模型。利用所述的一种VEGFB敲除载体构建肿瘤抑制动物模型的方法，所述VEGFB敲除载体转入动物体内，即得肿瘤抑制动物模型；具体方法为：VEGFB在外显子2和外显子4上分别设计一个sgRNA,插入pX330质粒获得pX330-sgRNA1和pX330-sgRNA2，将纯化得到的pX330-sgRNA1和pX330-sgRNA2混合，显微注射到小鼠受精卵原核中，获得转基因小鼠。本专利技术中构建的VEGFB肿瘤诱导模型和肿瘤抑制模型主要分为如下两部分：（1）转基因载体的构建：VEGFB过表达载体选取aP2-pLVCT，该载体含有5.5kb的aP2启动子；以小鼠cDNA为模板PCR扩增VEGFB基因CDS区；酶切纯化DNA片段进行显微注射，浓度为2.5-4ng/ul；VEGFB敲除载体选用PX330，sgRNA设计和筛选；纯化得到的pX330-sgRNA1和pX330-sgRNA2进行显微注射，浓度为2.5-4ng/ul。（2）受精卵细胞核显微注射：1）促排卵素注射、合笼；2）分离超排受精卵；3)显微注射DNA片段或载体；4）胚胎37℃过夜培养；5）二细胞期受精卵移植到代孕雌鼠体内。本专利技术提供了VEGFB基因作为抗肿瘤的靶基因，根据我们构建的VEGFB敲除小鼠的肿瘤明显被抑制的现象以及VEGFB脂肪组织过表达小鼠促进肿瘤生长的现象，我们发现外源性抑制VEGFB能够抑制肿瘤的生长且外源性过表达能够促进肿瘤生长，据此，我们可以将VEGFB基因作为肿瘤治疗的靶点，开发针对VEGFB基因的抗癌药物。目前，有很多抗癌药物是针对VEGF基因的药物，主要作用原理是干扰VEGF的血管生成的作用，减少机体对肿瘤营养物质的供应，从而抑制肿瘤生长。但是，此疗法只在用药初期有疗效，随后病情会恶化引发其他并发症，这是因为VEGF基因对正常机体维持毛细血管起着重要作用。目前研究发现VEGFB基因单条染色体敲除或者完全敲除，并不影响小鼠的生殖与健康状况，只是引起一定范围的体重的增加。从而，开发针对VEGFB的抗肿瘤药物不仅能够抑制肿瘤的生长，同时不会像其他抑制血管生成药物那样损害患者身体健康。因此，针对VEGFB基因开发相关的抗癌药物具有极其重要的临床应用价值。附图说明图1为CRISPR-Cas9作用原理；图2为pX330载体图；图3为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.VEGFB基因作为预防和/或治疗癌症的药物靶点的应用。

【技术特征摘要】
1.VEGFB基因作为预防和/或治疗癌症的药物靶点的应用。2.VEGFB基因的过表达在构建肿瘤诱导动物模型中的应用。3.VEGFB基因的敲除在构建肿瘤抑制动物模型的应用。4.VEGFB基因的抑制剂或拮抗剂在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。5.一种VEGFB过表达载体，其特征在于：含有编码VEGFB基因的核苷酸序列。6.一种VEGFB敲除载体，其特征在于：含有分别位于VEGFB外显子2和外显子4上的20bp的两个sgRNA。7.根据权利要求5所述的一种VEGFB过表达载体，其特征在于：所述过表达载体中还含有aP2启动子。8.根据权利要求6所述的一种VEGFB敲除载体，其特征在于：所述VEGFB敲除载体利用CRASPR-Cas9技术构建。9.利用权利要求5所述的一种VEGFB过表达载体构建肿瘤诱导动物模型的方法，其特征在于：所述VEGFB过表达载体转入动物体内...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑耀武，陈阳，
申请(专利权)人：东北师范大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22