一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法，本发明专利技术首次同时利用特定的5种不同的芽孢衣壳蛋白作为分子载体将海藻糖合酶展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面上，通过基因工程手段将海藻糖合酶TreS基因分别与芽孢衣壳蛋白CotA、CotC、CotE、CotG和CotH编码基因融合，利用枯草芽孢杆菌整合型质粒作为载体，转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到一种可以高效芽孢表面展示海藻糖合酶的基因工程菌，极大地提高了海藻糖合酶在芽孢表面展示的效率，而在采用其他芽孢衣壳蛋白进行类似展示海藻糖合酶分子时，未发现该现象，这为后续提高海藻糖合酶在芽孢表面展示的效率提供了新的途径。

【技术实现步骤摘要】
一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法
本专利技术涉及一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法，属于基因工程和发酵工程

技术介绍
海藻糖是一种普遍存在的非还原性双糖，由葡萄糖通过α-1,1-糖苷键连接，并广泛存在于植物、动物和微生物中。自1974年海藻糖作为能量储存物质和细胞壁组成物质被认识后，其功能和应用也逐渐被开发。随着对海藻糖认知程度的增加，海藻糖在各方面的应用得到不断拓展，在医药、食品、农业等领域得到广泛推广。研究表明，海藻糖的功能主要有以下三点：(1)作为碳源和能量储存物质；(2)作为蛋白和膜结构的稳定和保护物质；(3)作为细菌细胞壁的一种结构组成成分。海藻糖对生物体具有特殊的保护作用，其在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣条件下，能够在细胞表面形成独特的保护膜，有效保护蛋白分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。这一独特功能使得海藻糖除了作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的活性保护剂外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品变质、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料。随着海藻糖应用的不断探索，其功能和效果得到认可，这使得海藻糖的市场需求量逐渐增加，目前海藻糖的市场价格仍高于其他双糖，如蔗糖和麦芽糖。由于其生产工艺的复杂性，原材料的限制性以及工业化生产的实用性等方面的因素，使得海藻糖的生产量难以满足市场需求，因此对其生产各方面仍需不断创新和提高。海藻糖合酶能够将由α,α-1,4-糖苷键连接的麦芽糖直接转化为由α,α-1,1-糖苷键连接的海藻糖，该反应不需要磷酸盐的存在，不需要消耗高能物质，且底物专一性强，只作用于麦芽糖生成海藻糖及其逆反应，反应倾向于生成海藻糖方向，转化率约为70％-80％。目前麦芽糖制备工艺已非常纯熟，不仅制备成本低，且麦芽糖溶液纯度高，因此利用海藻糖合酶制备海藻糖具有原料优势，便于海藻糖的生产应用。海藻糖转化法通过一步转化，工艺简单，便于调控，目前被认为是海藻糖工业化生产的最优方法。芽孢表面展示系统是将目的基因与芽孢衣壳蛋白编码基因进行融合，利用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭型质粒或整合型质粒作为载体，将其转化到枯草芽孢杆菌中，诱导菌株产生芽孢后，目的基因能在芽孢衣壳蛋白基因启动子或其他启动子的控制下实现与芽孢衣壳蛋白的融合表达，从而在芽孢衣壳蛋白的锚定作用下使外源蛋白展示在芽孢表面。枯草芽孢杆菌的芽孢作为表面展示系统具有以下优点：(1)枯草芽孢杆菌是好氧微生物，并且是典型的革兰氏阳性微生物，属于GRAS分类，生长所需营养要求低；(2)芽孢是在母细胞中自然形成的；(3)细胞质中的分子伴侣可适当促进异源蛋白的正确折叠。中国专利文献CN105132450A(申请号201510571328.3)公开了一种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法。该专利技术利用Cot系列芽孢衣壳蛋白作为芽孢表面展示外源蛋白的分子载体，设计出Cot分子载体的系列引物，通过双酶切既可以替换分子载体又可以更改外源目的蛋白，最后通过基因技术将海藻糖合酶展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，筛选出可以高效展示海藻糖合酶的芽孢衣壳蛋白。虽然该技术方案中采用Cot系列芽孢衣壳蛋白作为芽孢表面展示外源蛋白的分子载体可以表面展示海藻糖合酶，但展示效率太低，无法满足工业化应用的要求。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法。本专利技术通过筛选，发现当五种不同的枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白同时作为分子载体，在整合型质粒pDG1730的基础上构建一个可以高效芽孢表面展示海藻糖合酶的载体，通过电转化的方法将重组载体转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到一种可以高效芽孢表面展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌。本专利技术技术方案如下：一种芽孢表面高效展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌，利用整合载体pDG1730将芽孢衣壳蛋白cotA、cotC、cotE、cotG、cotH分别与海藻糖合酶基因treS进行融合获得的融合基因片段At-Ct-Et-Gt-Ht，然后转化枯草芽孢杆菌WB800n，即得。根据本专利技术优选的，所述融合基因片段At-Ct-Et-Gt-Ht核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。上述芽孢表面高效展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，步骤如下：(1)以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，PCR扩增芽孢衣壳蛋白中CotA，CotC，CotE，CotG和CotH蛋白的基因序列；以恶臭假单胞菌PseudomonasputidaP06为模板扩增分别与上述芽孢衣壳蛋白中CotA，CotC，CotE，CotG和CotH蛋白的基因序列对应的重叠PCR扩增海藻糖合酶treS的基因序列；所述CotA蛋白基因的扩增引物如下所示：cotA-FaaaactggtctgatcggatccCGACCCGATATCCTGCCTTABamHIcotA-RgctgggtcatTTTATGGGGATCAGTTATATCCATCG所述CotC蛋白基因的扩增引物如下所示：cotC-FaccaccaccaccactgaGGTGGCGGTGGCTCGGGCcotC-RggctgggtcatGTAGTGTTTTTTATGCTTTTTATACTCTACAA所述CotE蛋白基因的扩增引物如下所示：cotE-FcaccaccaccactgaCGAGCTCGCTCTCTAAACACGcotE-RtcctgaagaaATGACCCAGCCCGACCCG所述CotG蛋白基因的扩增引物如下所示：cotG-FaccactgaGTTTAAACCGTAAAGCGGTAAATTGGATTGAPmeIcotG-RcgggctgggtcatTTTGTATTTCTTTTTGACTACCCAGC所述CotH蛋白基因的扩增引物如下所示：cotH-FcaccaccaccactgaCGAGCTCGCCTTCTTTTTTTGcotH-RcgggtcgggctgggtcatTAAAATACTTAAATGAT所述与CotA蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶treS基因序列的扩增引物如下所示：cotA-treS-FtccccataaaATGACCCAGCCCGACCCGcotA-treS-RaccTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT所述与CotC蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶Tres基因序列的扩增引物如下所示：cotC-treS-FaaacactacATGACCCAGCCCGACCCGcotC-treS-RtttagagagcgagctcgTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT所述与CotE蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶treS基因序列的扩增引物如下所示：cotE-treS-FgtttttagtgggagatcctgaagaaATGACCCAGCCCGACcotE-treS-RctgcaggaattcgataagcttGTTTAAACTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTHindIII、PmeI所述与CotG蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶treS基因序列的扩增引物如下所示：cotG-treS-FatacaaaATGACCCAGCCCGACCCGcotG-treS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种芽孢表面高效展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌，利用整合载体pDG1730将芽孢衣壳蛋白cotA、cotC、cotE、cotG、cotH分别与海藻糖合酶基因treS进行融合获得的融合基因片段At‑Ct‑Et‑Gt‑Ht，然后转化枯草芽孢杆菌WB800n，即得。

【技术特征摘要】
1.一种芽孢表面高效展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌，利用整合载体pDG1730将芽孢衣壳蛋白cotA、cotC、cotE、cotG、cotH分别与海藻糖合酶基因treS进行融合获得的融合基因片段At-Ct-Et-Gt-Ht，然后转化枯草芽孢杆菌WB800n，即得。2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述融合基因片段At-Ct-Et-Gt-Ht核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：(1)以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，PCR扩增芽孢衣壳蛋白中CotA，CotC，CotE，CotG和CotH蛋白的基因序列；以恶臭假单胞菌PseudomonasputidaP06为模板扩增分别与上述芽孢衣壳蛋白中CotA，CotC，CotE，CotG和CotH蛋白的基因序列对应的重叠PCR扩增海藻糖合酶treS的基因序列；所述CotA蛋白基因的扩增引物如下所示：cotA-FaaaactggtctgatcggatccCGACCCGATATCCTGCCTTABamHIcotA-RgctgggtcatTTTATGGGGATCAGTTATATCCATCG所述CotC蛋白基因的扩增引物如下所示：cotC-FaccaccaccaccactgaGGTGGCGGTGGCTCGGGCcotC-RggctgggtcatGTAGTGTTTTTTATGCTTTTTATACTCTACAA所述CotE蛋白基因的扩增引物如下所示：cotE-FcaccaccaccactgaCGAGCTCGCTCTCTAAACACGcotE-RtcctgaagaaATGACCCAGCCCGACCCG所述CotG蛋白基因的扩增引物如下所示：cotG-FaccactgaGTTTAAACCGTAAAGCGGTAAATTGGATTGAPmeIcotG-RcgggctgggtcatTTTGTATTTCTTTTTGACTACCCAGC所述CotH蛋白基因的扩增引物如下所示：cotH-FcaccaccaccactgaCGAGCTCGCCTTCTTTTTTTGcotH-RcgggtcgggctgggtcatTAAAATACTTAAATGAT所述与CotA蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶treS基因序列的扩增引物如下所示：cotA-treS-FtccccataaaATGACCCAGCCCGACCCGcotA-treS-RaccTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT所述与CotC蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶Tres基因序列的扩增引物如下所示：cotC-treS-FaaacactacATGACCCAGCCCGACCCGcotC-treS-RtttagagagcgagctcgTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT所述与CotE蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶treS基因序列的扩增引物如下所示：cotE-treS-FgtttttagtgggagatcctgaagaaATGACCCAGCCCGACcotE-treS-RctgcaggaattcgataagcttGTTTAAACTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTHindIII、PmeI所述与CotG蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶treS基因序列的扩增引物如下所示：cotG-treS-FatacaaaATGACCCAGCCCGACCCGcotG-treS-RaaaagaaggcgagctcgTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT所述与CotH蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶treS基因序列的扩增引物如下所示：cotH-treS-FcacaatacctcaaagatcatttaagtattttaATGACCCAGCCCGACcotH-treS-RctgcaggaattcgataagcttTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTHindIII(2)分别采用重叠PCR将步骤(1)制得的芽孢衣壳蛋白cotA、cotC、cotE、cotG、cotH与其对应的海藻糖合酶基因片段treS分别融合，制得cotA-treS(At)、cotC-treS(Ct)、cotE-treS(Et)、cotG-treS(Gt)和cotH-treS(Ht)五种融合基因片段；所述cotA-treS融合基因片段核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述c...

【专利技术属性】
技术研发人员：王腾飞，刘洪玲，杨少杰，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37