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一种抗TMP兔多克隆抗体的制备方法技术

技术编号:20349403 阅读:58 留言:0更新日期:2019-02-16 11:25
本发明专利技术涉及抗TMP兔多克隆抗体的制备方法,取促血小板生成素模拟肽(TMP)与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,制得KLH‑TMP作为免疫抗原,用纯化后的抗原免疫新西兰白兔,收集兔子血液制备抗血清,从中分离纯化出抗TMP兔的多克隆抗体。该抗体血清经盐析法纯化后纯度可达85%以上。本发明专利技术制备的抗体具有高纯度、高特异性和高亲和力的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种抗TMP兔多克隆抗体的制备方法
本专利技术属于基因工程制药领域,并具体地涉及微生物学、免疫学领域,特别涉及一种多克隆抗体的制备方法。
技术介绍
血小板生成素(thrombopoietin,TPO),又称巨核细胞生长发育因子(MegakaryocyteGrowthDevelopmentFactor,MGDF),是Kelemen等人于1958年发现的,在人体血液中存在的一种调节血小板生成的激素样物质。人TPO基因位于第3号染色体长臂上(q26-27),其编码的TPO蛋白由332个氨基酸组成,含有两个功能区域:153个氨基酸组成的N端,以及179个氨基酸组成的C端(林放,2012)。TPO具有促进巨核细胞增殖、分化与成熟,促进血小板生成的作用,是首个被发现的、也是最重要的血小板生成调节因子。1997年,通过噬菌体展示技术,Cwirla等人筛选到一种与内源TPO无同源序列的14个氨基酸组成的TPO模拟肽(thrombopoietinmimeticpeptide,TMP)。对于恶性肿瘤放疗和化疗、肝炎、爱滋病、以及骨髓移植等原因引起的血小板减少症,国内目前尚缺乏安全有效的治疗药物。虽然第一代重组促血小板生成素在90年代中期就进入了临床研发,但因其产生中和性抗体未能走出临床。目前,全球范围内仅在我国上市(rhTPO)。促血小板生成素模拟肽(TMP)与人体内源TPO非同源但具有良好的生物活性,美国安进公司将其与免疫球蛋白的Fc段融合,该融合蛋白克服了短肽TMP半衰期短的缺点,同时具有TPO活性,也不会产生中和性抗体。该融合蛋白已被美国FDA批准上市,用于治疗慢性特发性血小板减少症(ITP)。该融合蛋白的缺点是由于Fc为非惰性蛋白,它会带来免疫副作用。合理的免疫程序是影响抗体产生的重要因素,现有的TMP抗体的生产成本较高、纯度较低并且特异性和亲和力较低。多克隆抗体(Polyclonalantibodies,PcAb)是指由多种抗原决定簇刺激产生的混合抗体,具有生产成本低、生产周期短、对抗原亲和力强等优点(沈金儿,2013)。新西兰白兔性情温顺,容易饲养,是一种常用的实验室制备抗体的免疫动物;相对鼠源多克隆抗体,兔源多抗通常具有更高的亲和力和特异性,兔多克隆抗体制备技术也比较成熟。钥孔血蓝蛋白(KLH,keyholelimpethemocyanin)是具有高度免疫原性的蛋白大分子,作为载体蛋白用于免疫原的制备,交联于半抗原和其他抗原,可以增强它们的免疫原性。本实验室自2009年开始,就致力于TMP长效融合蛋白的研究。通过人血清白蛋白融合技术,在专利CN201310084212.8中公开了二聚体化促血小板生成素模拟肽TMP二联体一人血清白蛋白融合蛋白的制备及应用。林放,三种血小板生成关键因子共转染人骨髓基质细胞的实验研究[D],2012,第三军医大学沈金儿,抗GNA兔单克隆抗体的制备及其夹心ELISA枪测体系的建立[D],2013,浙江大学
技术实现思路
为了获得高效价、高特异性、高亲和力的抗TMP多克隆抗体,本专利技术采用少量、多次、长周期的免疫方法,并添加佐剂以增强机体产生的免疫应答,以新西兰白兔为免疫动物进行抗体制备。整个免疫过程为期58天,共免疫5次,抗体血清经盐析法纯化后纯度可达85%以上。本专利技术制备的抗体具有高纯度、高特异性和高亲和力的特点。本专利技术提供抗TMP兔多克隆抗体血清的制备方法:取促血小板生成素模拟肽TMP与钥孔血蓝蛋白KLH偶联,制得KLH-TMP作为免疫抗原,加入福氏完全佐剂、乳化后,分批次免疫新西兰白兔,免疫后第58天收集血清,从中分离纯化出抗TMP兔的多克隆抗体,其中促血小板生成素模拟肽TMP的碱基序列如SEQIDNO:1所示,促血小板生成素模拟肽TMP的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。其具体步骤为:(1)取血小板生成素模拟肽TMP与钥孔血蓝蛋白KLH偶联,KLH-TMP融合蛋白纯度大于95%;(2)取1mg/ml免疫抗原KLH-TMP2.5mg,加入2.5ml福氏完全佐剂、乳化。(3)取2只新西兰白兔,编号分别为1#和2#,颈背部8点注射,每点0.1-0.2mg抗原(皮内注射两点0.1ml;肌肉注射0.3ml;皮下注射0.2ml);(4)在免疫后第15、29、43天,分别用4.5mg免疫抗原KLH-TMP蛋白(1mg/ml)与4.5ml福氏不完全佐剂乳化,以同样的方式注射;(5)在第四次免疫10天后,进行耳缘静脉或肌肉加强免疫1ml无佐剂抗原;(6)在免疫后第58天,颈动脉取血,将兔子处死;(7)兔血在4℃放置过夜后,4000g离心收集上清,从中分离纯化出抗TMP兔的多克隆抗体。本专利技术还提供一种抗体血清的盐析法纯化方法:(1)取离心收集的兔血清加入等体积生理盐水,搅拌下逐滴加入与稀释血清等量的饱和(NH4)2SO4,于4℃静置沉淀3h以上后,4000g离心20min,弃去上清;(2)以生理盐水溶解沉淀至Xml,再逐滴加入饱和硫酸铵X/2ml,于4℃静置沉淀3h以上后,4000g离心20min,弃去上清;(3)重复第二步,将末次离心后的沉淀物以0.02MPBS(pH7.4)溶解至Xml,以PBS充分透析,至萘氏试剂测透析外液无黄色。(4)将透析袋内样品稀释后,以紫外分光光度计测蛋白含量。本专利技术还提供抗体血清SDS-PAGE凝胶电泳分析多克隆抗体纯度的分析方法:(1)配置12%的分离胶和5%的浓缩胶;(2)取0.1μl和1μl纯化抗体,分别用去离子水稀释至20μl后加入5μl5×上样缓冲液,于100℃金属浴变性10min;(3)130V,电泳90min(夏季70min);(4)考马斯亮蓝R250染色液染色4-6h;(5)脱色液脱色2-3h后,进行凝胶成像。本专利技术还提供多克隆抗体的Westernblot鉴定方法:(1)PVDF膜活化:裁剪适合大小的PVDF膜,在甲醇中浸泡5min后使用去离子水洗涤两次,每次3min,洗涤后再将膜置于转膜缓冲液浸泡10min。同时裁剪与膜大小相同的滤纸8张,置于转膜缓冲液浸泡备用;(2)分别取阴性血清(阴性对照)、前期细胞和酵母表达、纯化的dTMP-HSA融合蛋白(阳性对照)进行还原性SDS-PAGE凝胶电泳,电泳结束后,从玻璃板中剥离凝胶,切下适合大小的含有目标条带的凝胶;(3)将PVDF膜、凝胶和滤纸按以下顺序叠放:(-)阴极-4张滤纸-凝胶-PVDF膜-4张滤纸-阳极(+),并根据膜的大小,选择恒压或恒流方式进行转膜;(4)转膜结束后,取出PVDF膜,凝胶接触面向上置于洁净容器中,用洗涤缓冲液洗涤3次,每次5min;(5)将PVDF膜转入封闭液,室温震荡孵育2h;(6)封闭后使用洗涤缓冲液洗涤4次,每次5min。洗涤后,将PVDF膜转入一抗稀释液(使用洗涤缓冲液以1:2000比例稀释纯化后的抗TMP兔多克隆抗体),室温震荡孵育2h后静置于4℃过夜;(7)使用洗涤缓冲液洗涤4次,每次5min。洗涤后,将PVDF膜转入二抗稀释液(使用洗涤缓冲液以1:5000比例稀释HRP酶标羊抗兔IgG),室温震荡孵育1h;(8)使用洗涤缓冲液洗涤3次,每次10min。洗涤后,将PVDF膜转入DAB显色液,于避光环境下逐滴加入30%H2O2,观察显色条带。本专利技术还提供兔本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种抗TMP兔多克隆抗体的制备方法,取促血小板生成素模拟肽(TMP)与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,制得KLH‑TMP作为免疫抗原,加入福氏完全佐剂、乳化后,分批次免疫新西兰白兔,免疫后收集血清,分离纯化出抗TMP兔的多克隆抗体,其中TMP的碱基序列如SEQ ID NO:1所示,TMP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗TMP兔多克隆抗体的制备方法,取促血小板生成素模拟肽(TMP)与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,制得KLH-TMP作为免疫抗原,加入福氏完全佐剂、乳化后,分批次免疫新西兰白兔,免疫后收集血清,分离纯化出抗TMP兔的多克隆抗体,其中TMP的碱基序列如SEQIDNO:1所示,TMP的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。2.根据权利要求1所述的一种抗TMP兔多克隆抗体的制备方法,其特征在于,其具体步骤为:(1)取血小板生成素模拟肽(TMP)与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,KLH-TMP融合蛋白纯度大于95%;(2)取2.5mg的KLH-TMP作为免疫抗原,加入2.5ml福氏完全佐剂、乳化;(3)取新西兰白兔,颈背部选择8点注射抗原,每点0.1-0.2mg抗原;(4)在免疫后第15、29、43天,分别用4.5mg的KLH-TMP作为免疫抗原蛋白与4.5ml福氏不完全佐剂乳化,以同样的方式注射;(5)在免疫后第53天后,进行耳缘静脉或...

【专利技术属性】
技术研发人员:李红玉付秀峰茹毅李洋
申请(专利权)人:兰州大学
类型:发明
国别省市:甘肃,62

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