一种检测细胞内质网内次氯酸的双光子荧光探针制造技术

本发明专利技术提供了一种检测细胞内质网内次氯酸的双光子荧光探针：

【技术实现步骤摘要】
一种检测细胞内质网内次氯酸的双光子荧光探针
本专利技术涉及一种检测细胞内质网内次氯酸的双光子荧光探针及其应用，属于小分子荧光材料领域。
技术介绍
作为细胞内重要的细胞器，内质网（endoplasmicreticulum，ER）对整个细胞起着非常重要的作用。它是细胞内蛋白质合成、折叠、Ca2+储备和Ca2+参与胞内信号转导的重要场所，同时也是类固醇、胆固醇及其他脂类的合成场所。内质网的主要生理功能包括调节蛋白质合成、折叠和定位，以及维持细胞内的Ca2+平衡。而内质网内环境的改变具有高度的敏感性，故细胞受到化学毒性物质刺激时内质网正常的生理功能就会受到损伤，从而发生内质网应激。内质网应激过强或持续时间过久可引起细胞凋亡。因此，内质网应激与众多人类疾病如癌症、炎症性疾病、代谢性疾病、骨质疏松症及神经退行性疾病等的发生发展密切相关。生命体内的内源性次氯酸是一种重要的活性氧物种（Reactiveoxygenspecies，ROS），在生物体内具有重要的生理功能，参与众多生理过程，尤其是在免疫系统抵制外侵的细菌中起着极其重要的作用。内源性的次氯酸是由过氧化氢和氯离子在髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）的催化作用下反应产生的，有重要的抗菌性能。由于次氯酸的高反应性和非特异性，一旦生命体饮用或者接触了次氯酸含量较高的水体，导致生命体内的次氯酸含量不能维持在正常的生理水平范围内，将会破坏宿主组织，引起一系列的疾病，如：炎症性疾病、神经衰弱、肾脏疾病、心血管疾病和某些癌症等。区别于传统的紫外吸收法、电化学法及色谱法等分析方法，荧光分析法具有选择性好、灵敏度高及操作简便等特点，并且能够在不损伤生物样品的情况下实时检测生物活性分子并成像。由于荧光分析法的这些优点，近年来有大量检测生物活性分子的荧光探针被报道。内质网作为一类重要的细胞器，是细胞内产生活性氧物种(ROS)和活性硫物种(RSS)的主要场所，次氯酸是由过氧化氢和氯离子在髓过氧化物酶的催化作用下反应产生的，因内质网中次氯酸的检测分析具有重要的研究价值，并且有助于研究内质网诱导的细胞凋亡过程。至今，已有一些荧光探针应用于内质网靶向的文献报道，但是由于其或水溶性不佳或选择性不好或检测区间窄及线性关系不优等缺点而限制其应用。因此，设计内质网靶向的次氯酸荧光探针具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种细胞内质网靶向的检测次氯酸的双光子荧光探针，特异性高、不受干扰。本专利技术的另一目的是提供上述双光子荧光探针的合成方法，原料廉价易得，制备成本低。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种检测细胞内质网内次氯酸的双光子荧光探针，其结构式如式（I）所示：式（I）。上述双光子荧光探针可以采用以下方法合成：（1）4-甲硫基-1,8-萘二甲酸酐与BOC-己二胺在乙醇中加热回流，产物分离纯化，得化合物1：；（2）化合物1与三氟乙酸在二氯甲烷中室温搅拌反应，产物分离纯化得化合物2：；（3）化合物2与对甲苯磺酰氯在二氯甲烷中在三乙胺存在下反应，产物分离纯化得终产物，即荧光探针：。步骤（1）中，所述4-甲硫基-1,8-萘二甲酸酐与BOC-己二胺的摩尔比为1-1.2:1。步骤（1）中，所述反应温度为90℃；反应时间为4-6小时。步骤（1）中，所述分离纯化操作为以乙酸乙酯：石油醚=3:1（v/v）为淋洗液过硅胶层析柱。步骤（2）中，化合物1与三氟乙酸的摩尔比为1:1-1.2。步骤（2）中，反应时间为2-6小时。步骤（2）中，所述分离纯化操作为以甲醇：二氯甲烷：三乙胺=15:1:0.05（v/v）为淋洗液过硅胶层析柱。步骤（3）中，化合物2与对甲苯磺酰氯的摩尔比为1:1-1.5。步骤（3）中，所述反应温度为0-5℃；反应时间为2-5小时。步骤（3）中，所述分离纯化操作为以二氯甲烷：甲醇=100:1（v/v）为淋洗液过硅胶层析柱。一种上述双光子荧光探针在检测溶液或细胞内质网中次氯酸的应用。上述探针的荧光机理如下：在次氯酸存在的条件下，探针分子中的甲硫基发生氧化反应反应，此时荧光发生淬灭。同时，由于对甲苯磺酰胺具有内质网靶向性，可以将内质网和其他细胞器区分，因此该荧光探针可以用于检测细胞内质网内的次氯酸。本专利技术具有以下优点：本专利技术所述的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。本专利技术所述的荧光探针具有高特异性，在进行相应次氯酸检测过程中不受其他组分的干扰，可用于活细胞内质网内次氯酸的实时测定，具有广阔的应用前景。本专利技术所述的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性，通过绘制标准曲线进行细胞内质网内内次氯酸的测定，可以实现对细胞内质网中的次氯酸快速准确检测的目的。附图说明图1是荧光探针的1HNMR图谱；图2是荧光探针在不同浓度次氯酸条件下的荧光光谱；图3是荧光探针与次氯酸浓度的线性关系数据；图4是荧光探针对不同物质的选择性；图5是荧光探针与商业探针的共定位生物成像图；图6是荧光探针检测活细胞中次氯酸的生物成像图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1荧光探针的合成（1）将120mg4-甲硫基-1,8-萘二甲酸酐溶于约150mL乙醇中回流加热至90℃20min，将BOC-己二胺溶于2mL乙醇后滴加至反应液中，继续回流搅拌4小时，冷却后过滤，将滤液旋干后，以乙酸乙酯：石油醚=3:1（v/v）过硅胶柱层析得到黄色产物（化合物1）；（2）将步骤（1）得到的产物用约20mL二氯甲烷室温下溶解，并将用约1.2mL二氯甲烷溶解的2.5mL三氟乙酸滴加至反应液中，室温下搅拌3小时，然后旋干产物，以甲醇：二氯甲烷：三乙胺=15:1:0.05（v/v）为淋洗液过硅胶层析柱，得黄色产物（化合物2）；（3）将步骤（2）得到的225mg黄色固体和90mg三乙胺溶于约25mL二氯甲烷中，并将120mg对甲苯磺酰氯溶于2mL二氯甲烷中，在冰盐浴条件下将溶解后的对甲苯磺酰氯缓慢滴加至反应液中并继续搅拌3小时，柱层析得黄色固体，产率85%，即荧光探针，简称为NHS-ER；其1HNMR图谱见图1。各步骤反应式如下：。实施例2荧光探针对不同浓度次氯酸的响应将实施例1中获得的探针，用乙醇溶解后，以pH为7.4的PBS缓冲液配制成10μM探针缓冲溶液（含10%乙醇）。取26份上述探针溶液，分别加入相同体积的水或次氯酸钠溶液，使次氯酸根浓度依次为0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300，320，340，360，380，400μM。然后进行荧光扫描（λEx=405nm）；计算各体系中相对荧光强度。探针NHS-ER对不同浓度次氯酸的响应如图2所示：其最大荧光强度峰值为502nm。以502nm处相对应光强度（I502nm）为纵坐标，以次氯酸根浓度为横坐标，得图3，可知I502nm处的荧光强度与次氯酸根浓度呈线性相关，随着次氯酸根浓度的增大荧光强度减弱。实施例3荧光探针的选择性将实施例1中获得的探针，用乙醇溶解后，以pH为7.4的PBS缓冲液配制成10μM探针缓冲溶液（含10%乙醇）。取20份上述探针溶液，分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测细胞内质网内次氯酸的双光子荧光探针，其结构式如式（I）所示：

【技术特征摘要】
1.一种检测细胞内质网内次氯酸的双光子荧光探针，其结构式如式（I）所示：式（I）。2.一种如权利要求1所述的双光子荧光探针的合成方法，其特征在于，采用以下步骤：（1）4-甲硫基-1,8-萘二甲酸酐与BOC-己二胺在乙醇中加热回流，产物分离纯化，得化合物1：；（2）化合物1与三氟乙酸在二氯甲烷中室温搅拌反应，产物分离纯化得化合物2：；（3）化合物2与对甲苯磺酰氯在二氯甲烷中在三乙胺存在下反应，产物分离纯化得终产物，即荧光探针：。3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述4-甲硫基-1,8-萘二甲酸酐与BOC-己二胺的摩尔比为1-1.2:1；化合物1与三氟乙酸的摩尔比为1:1-1.2；化合物2与对甲苯磺酰氯的摩尔比...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，宋文辉，董宝利，孔秀琪，张楠，卢雅茹，李敏，赵畅，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37