一种抗菌剂毒性的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种抗菌剂毒性的检测方法，包括：使秀丽线虫暴露于待测样品中，根据秀丽线虫的身体长度、身体弯曲频率、头部摆动频率、后代数、孵化时间、世代时间和/或种群规模评价抗菌剂对生长发育、神经系统和/或生殖系统的毒性；所述待测样品含有抗菌剂。与现有技术相比，本发明专利技术提供的抗菌剂毒性的检测方法快捷高效，实验周期短，对仪器要求少，并可以估算出日常护理产品中抗菌剂安全使用的范围；同时本发明专利技术提供的检测方法为推测抗菌剂对后代的影响提供了技术基础，可以得出抗菌剂对亲代线虫及其后代产生的影响。

【技术实现步骤摘要】
一种抗菌剂毒性的检测方法
本专利技术属于毒性检测
，尤其涉及一种抗菌剂毒性的检测方法。
技术介绍
秀丽线虫(Caenorhabditiselegans)是一种可独立生存的小型生物，可以在世界上许多地方存活，主要是以细菌为食。作为常见模式生物，秀丽线虫具有生命周期短，基因组紧凑、易培养，体积小、繁殖速度快、对毒物敏感等优势。最重要的是，线虫体内超过40％的基因是与人类同源的；并且，在17种已报道过的信号通路中，有12种已经在线虫和人体内被发现。目前，它已经成功应用于各领域生物效应研究，包括基因组学、细胞生物学、神经学和衰老学科。从解剖学上看，成虫体内的结构是简单的，大概有1000个体细胞。秀丽线虫适合于遗传杂交并且每个成虫均可以生育很多后代。在适宜的条件下，秀丽线虫的生命周期大约是3天。同时，线虫可以在实验室内培养，培养的条件是固体或者液体培养基，食物来源是E.coli。由于线虫在整个生命周期都是透明的，可以在微分干涉差显微镜下观察到体内细胞层次，且整个秀丽线虫的解剖学描述已经在电子显微镜下完成，同时建立了动物之间具有共性的完整细胞谱系。秀丽线虫只有两种性别：雌雄同体(XX)和雄性(XO)。雌雄同体占大部分，雄性个体一般只占群体0.2％。雌雄同体可以自体受精产生遗传上相同的后代，也可以通过雄性交配促进突变菌株的分离与维持。目前，秀丽线虫在毒性评价中的应用日趋成熟。很多文献采用了行为学的指标，包括体长、头部摆动、身体弯曲等。但是尚无文章提出对抗菌剂采用线虫进行慢性暴露测试的方法研究。三氯卡班(TCC)是一种广谱抗菌剂，应用于个人护理，兽医，工业和家用产品。环境中三氯卡班的主要来源是废水和污泥；人类接触三氯卡班的方式有两种，一是和日常消费品直接接触，二是食用或饮用已污染的水和食物，这会导致它可以在人体的血液和尿液中检测到。从浓度和频率上看，三氯卡班是废水中十大常见有机物之一。三氯卡班对生态系统和人类的健康威胁主要包括抗菌剂的耐药性、生态毒性和潜在的内分泌干扰影响。就生态毒性而言，学者们已研究过抗菌剂对脊椎动物、鱼类、两栖动物、藻类和植物的急性毒性。但是抗菌剂的慢性毒性少有人研究，并且三氯卡班相比于其他抗菌剂研究的成果较少。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种抗菌剂慢性毒性的检测方法。本专利技术提供了一种抗菌剂毒性的检测方法，包括：使秀丽线虫暴露于待测样品中，根据秀丽线虫的身体长度、身体弯曲频率、头部摆动频率、后代数、孵化时间、世代时间和/或种群规模评价抗菌剂对生长发育、神经系统和/或生殖系统的毒性；所述待测样品含有抗菌剂。优选的，根据秀丽线虫的身体长度、身体弯曲频率、头部摆动频率、后代数、孵化时间和/或世代时间评价抗菌剂的毒性时，所述秀丽线虫为L1期线虫；根据秀丽线虫种群规模评价抗菌剂的毒性时，所述秀丽线虫为L4期线虫。优选的，所述抗菌剂为三氯卡班。优选的，所述评价抗菌剂对生长发育的毒性为所述秀丽线虫的体长小于1.14mm。优选的，所述评价抗菌剂对神经系统的毒性为秀丽线虫的身体弯曲频率低于9.6次/20秒；头部摆动频率低于120.6次/min。优选的，所述评价抗菌剂对生殖系统的毒性为后代数低于175条；世代时间大于87h；孵化时间延迟大于4h，相同时间的孵化率减少5％以上；种群规模减少38％以上。优选的，所述后代数具体按照以下步骤得到：将秀丽线虫暴露于待测样品中，生长至成虫期后，将秀丽线虫转移至固体培养基中，24h后计数，并将成虫转移至新的固体培养基中，重复上述操作，直至秀丽线虫不再产卵，得到总数为后代数。优选的，所述孵化时间与世代时间具体按照以下步骤得到：将秀丽线虫暴露于待测样品中，然后使用NaOH与NaClO溶液对虫子进行处理得到卵，从得到卵到卵孵化成L1秀丽线虫的时间为孵化时间；从得到卵到卵发育成成虫开始产卵的时间为世代时间。优选的，所述种群规模具体按照以下步骤得到：将L4期秀丽线虫暴露于待测样品中，进行培养，记录秀丽线虫总数。本专利技术提供了一种抗菌剂毒性的检测方法，包括：使秀丽线虫暴露于待测样品中，根据秀丽线虫的身体长度、身体弯曲频率、头部摆动频率、后代数、孵化时间、世代时间和/或种群规模评价抗菌剂对生长发育、神经系统和/或生殖系统的毒性；所述待测样品含有抗菌剂。与现有技术相比，本专利技术提供的抗菌剂毒性的检测方法快捷高效，实验周期短，对仪器要求少，并可以估算出日常护理产品中抗菌剂安全使用的范围；同时本专利技术提供的检测方法为推测抗菌剂对后代的影响提供了技术基础，可以得出抗菌剂对亲代线虫及其后代产生的影响。附图说明图1为暴露于不同浓度三氯卡班线虫后代数的柱形图；图2为暴露于不同浓度三氯卡班线虫孵化时间的曲线图；图3为暴露于不同浓度三氯卡班线虫世代时间的柱形图；图4为暴露于不同浓度三氯卡班线虫种群规模的曲线图；图5为暴露于不同浓度三氯卡班线虫身体弯曲频率的柱形图；图6为暴露于不同浓度三氯卡班线虫头部摆动次数的柱形图；图7为暴露于不同浓度三氯卡班线虫身体长度的柱形图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供了一种抗菌剂毒性的检测方法，包括：使秀丽线虫暴露于待测样品中，根据秀丽线虫的身体长度、身体弯曲频率、头部摆动频率、后代数、孵化时间、世代时间和/或种群规模评价抗菌剂对生长发育、神经系统和/或生殖系统的毒性；所述待测样品含有抗菌剂。本专利技术对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。本专利技术利用秀丽线虫对抗菌剂的毒性进行检测，减少线虫生长的影响，优选先对秀丽线虫进行同步化处理；所述同步化处理的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本专利技术中优选采用碱性次氯酸钠裂解法，更优选按照以下步骤进行：将秀丽线虫在接种有大肠杆菌OP50(EcoliOP50)的NGM固体培养基中，20℃培养，直至固体培养基中出现大量卵，然后用M9溶液冲洗含有秀丽线虫的固体培养基，得到虫液；将虫液静置，移去上清，再用M9溶液洗涤后，吸弃上清，然后加入M9溶液、氢氧化钠溶液与次氯酸钠溶液混合，震荡2～3min，直至虫体破碎后，离心，吸弃上清，并用M9溶液洗涤，转移至M9溶液中20℃培养24h，得到L1期线虫。将L1期线虫转移至NGM固体培养基20℃培养36～48h后，用M9溶液将NGM固体培养基上的线虫冲洗，自然沉降后，吸弃上清，重新加入M9溶液，重复沉淀、吸弃和加入步骤一次，吸弃上清后，得到L4期线虫。所述NGM固体培养基为本领域技术人员熟知的NMG固体培养基即可，并无特殊的限制，本专利技术中优选按照以下步骤制备：1.2gNaCl、6.8g琼脂、1g蛋白胨与390mL水混合，高温灭菌后，加入400μLMgSO4(浓度为1M)、400μLCaCl2(浓度为1M)、400μL胆固醇(浓度为5mg/mL，溶剂为无水乙醇)、10mLK3PO4缓冲溶液(浓度为1M，配置方法:10.83gKH2PO4，4.66gK2HPO4·3H2O)，混匀后，倒入6cm平板中，在超净台放置2～3天后，N本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗菌剂毒性的检测方法，其特征在于，包括：使秀丽线虫暴露于待测样品中，根据秀丽线虫的身体长度、身体弯曲频率、头部摆动频率、后代数、孵化时间、世代时间和/或种群规模评价抗菌剂对生长发育、神经系统和/或生殖系统的毒性；所述待测样品含有抗菌剂。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌剂毒性的检测方法，其特征在于，包括：使秀丽线虫暴露于待测样品中，根据秀丽线虫的身体长度、身体弯曲频率、头部摆动频率、后代数、孵化时间、世代时间和/或种群规模评价抗菌剂对生长发育、神经系统和/或生殖系统的毒性；所述待测样品含有抗菌剂。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，根据秀丽线虫的身体长度、身体弯曲频率、头部摆动频率、后代数、孵化时间和/或世代时间评价抗菌剂的毒性时，所述秀丽线虫为L1期线虫；根据秀丽线虫种群规模评价抗菌剂的毒性时，所述秀丽线虫为L4期线虫。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述抗菌剂为三氯卡班。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述评价抗菌剂对生长发育的毒性为所述秀丽线虫的体长小于1.14mm。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述评价抗菌剂对神经系统的毒性为秀丽线虫的身体弯曲频率低于9.6次/20秒；头部摆动频率低于120.6次/min。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：童中华，崇汉娟，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34