一种热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株制造技术

本发明专利技术涉及兽医病毒分子生物学技术和免疫学技术，公开了一株热稳定的新城疫病毒新型(基因Ⅷ型)弱毒疫苗候选株NDV/rAHR09及其构建方法。所述的热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株的保藏号为CCTCC NO:V201739。研究表明，NDV/rAHR09株具有良好的热稳定性，56℃、60min仍保持血凝活性和感染能力，免疫试验证明对新城疫强毒株有良好的免疫保护效果，与常用疫苗株LaSota和耐热的V4株分别接种1日龄SPF鸡，每周检测鸡的抗体效价，试验结果证明，本发明专利技术毒株免疫鸡的抗体效价显著高于LaSota株和V4株，对流行强毒株攻毒保护率为100％。

A Thermally Stable Candidate for Newcastle Disease Virus Attenuated Vaccine

The present invention relates to molecular biological and immunological techniques of veterinary viruses, and discloses a novel heat-stable attenuated vaccine candidate strain NDV/rAHR09 and its construction method. The storage number of the heat-stable attenuated vaccine candidate strain of Newcastle disease virus is CCTCC NO: V201739. The results showed that NDV/rAHR09 strain had good thermal stability and maintained hemagglutination activity and infection ability at 56 C and 60 min. Immunoassay showed that NDV/rAHR09 strain had good immune protection effect against Newcastle disease virulent strain. One-day-old SPF chickens were inoculated with LaSota and heat-resistant V4 strains, respectively. The antibody titers of chickens were tested weekly. The results showed that the antibody titers of the virus strain immunized chickens were remarkable. It was higher than LaSota strain and V4 strain, and the protection rate against virulent strains was 100%.

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株
本专利技术涉及兽医病毒分子生物学技术和免疫学领域，具体涉及一株新基因型、耐热的新城疫病毒弱毒疫苗候选株。
技术介绍
新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)对世界家禽养殖业危害巨大，它可以感染多种禽类，常导致养禽业产生巨大的经济损失[Alexander,D.J.2001.GordonMemorialLecture.Newcastledisease.BrPoultSci42:5-22.]。该病毒在分类学上属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的成员[Mayo,M.A.2002.Virustaxonomy-Houston2002.ArchVirol147:1071-1076.]。新城疫病毒有囊膜，基因组为单股、负链、不分节段的RNA病毒，基因组结构模式为：3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)即核蛋白(NP)，P，M，F，HN和L蛋白。根据对鸡的毒力，NDV毒株可以为强毒(Velogenic)、中等毒力(Mesogenic)和弱毒(Lentogen)三种类型。已有大量的研究已经阐明了病毒致病性的分子决定因素[HuangZ,KrishnamurthyS,PandaA,SamalSK.NewcastlediseasevirusVproteinisassociatedwithviralpathogenesisandfunctionsasanalphainterferonantagonist.Journalofvirology2003Aug；77(16):8676-85.]，其中大部分是关于F和HN蛋白对病毒毒力的作用，特别是一致认为F蛋白裂解位点处的氨基酸序列是病毒毒力的主要决定因素[SealBS.Nucleotideandpredictedaminoacidsequenceanalysisofthefusionproteinandhemagglutinin-neuraminidaseproteingenesamongNewcastlediseasevirusisolates.PhylogeneticrelationshipsamongtheParamyxovirinaebasedonattachmentglycoproteinsequences.FunctIntegrGenomics2004Oct；4(4):246-57.]。NDV毒力差异的分子基础主要决定于F0蛋白的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列，强毒的裂解位点两端有成对的碱性氨基酸序列，其模式基序为112R/K-R-Q-K/R-R-F117；弱毒的裂解位点则缺少聚碱性氨基酸序列，其模式基序为112-E/G-R/K-Q-E/G-R-L117。生产上需要疫苗进行预防接种控制NDV的感染与传播。常规的弱毒活疫苗对热敏感，在储存运输过程中需要冷链维持。澳大利亚早期分离鉴定了一些天然耐热的弱毒株，如V4、I-2等，这类毒株在基因型分类上属于基因I型，曾在非洲、东南亚等热带国家和地区作为疫苗毒株使用，减少了冷链的依赖，产生了很好的经济和社会效益(SpradbrowPB,CoplandJW.ProductionofthermostableNewcastlediseasevirusindevelopingcountries.PreventiveVeterinaryMedicine[J],1996,29:157–159.)。我国1990年代曾引进了V4等毒株，由于是国外的专利保护毒株，只能用于科研，不能进行商品化开发使用，因此我国南方热带农村地区(缺乏很好的冷链系统)缺乏可以使用的自主耐热疫苗株。另外，我国新城疫的流行情况复杂，传统的基因I型疫苗毒株对我国当前的流行毒株免疫保护效果并不理想，筛选、开发具有自主产权、耐热的新型新城疫弱毒疫苗株具有重要意义。NDV对热的耐受性不高，50～55℃、30min即可使其失去活性(失去感染宿主的能力)。早期的研究结果显示，在NDV不同毒力类型的毒株中，存在着对温度耐受性较高的毒株，主要表现为经56℃、30min处理后依然具有感染宿主的能力，或虽然丧失感染性，但仍具有HA活性。[LomnicziB.ThermostabilityofNewcastlediseasevirusstrainsofdifferentvirulence.ArchofVirol.1975,(47):249-255.]现在一般认为，经过56℃、30min热处理后仍具有感染能力的NDV毒株即为耐热性毒株。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种耐热的新基因型(Ⅷ型)新城疫病毒弱毒疫苗候选株NDV/rAHR09及其反向遗传构建系统，通过毒株自身具有的耐热性，解决弱毒活疫苗在储存、运输过程中对冷链的依赖，为热带地区和偏远的乡村地区(通常缺乏冷链系统)提供可靠的防控候选疫苗。本专利技术提供的一种热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株，是新城疫病毒基因Ⅷ型NDV/rAHR09，它的保藏号为CCTCCNO：V201739。本专利技术还公开了所述热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株NDV/rAHR09基因组序列，如SEQIDNo.47所示。本专利技术还公开了含有所述热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株NDV/rAHR09的基因组cDNA的全长转录载体。本专利技术中的耐热弱毒疫苗候选株NDV/rAHR09是从耐热强毒株NDV/HR09经过反向遗传操作系统对病毒F基因进行突变改造而来。NDV/HR09株是专利技术人所在实验室从送检病料中分离并经耐热性鉴定而获得，该毒株经56℃、60min仍具有血凝活性和感染细胞的能力，最小致死量鸡胚平均致死时间(MDT)为57.6h，1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.8，6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)为1.56，F基因片段构建的系统进化树证明毒株属于基因Ⅷ型，与马来西亚早期分离鉴定的耐热强毒株NDV/AF2240(GenBank号：JX012096)有较高的同源性，同源性为94.0％。本专利技术首先建立了HR09株的反向遗传操作系统，成功拯救获得了保留病毒原有生物学特性的感染性克隆。利用该操作系统，对病毒F基因裂解位点碱基序列进行突变，设计1对引物经OverlapPCR方法，对病毒HR09的F基因裂解位点处的核苷酸进行突变，使相应编码的氨基酸由112R-R-Q-K115-R-F117突变为具有典型弱毒株特征的氨基酸序列112G-R-Q-G115-R-L117，拯救获得的NDV/rAHR09株保留了原母系强毒株的耐热性，56℃处理60min仍然具有HA活性，但MDT值>120h，ICPI值为0.057，符合弱毒株的标准。经与传统疫苗株LaSota株、国外引进的耐热株V4株进行免疫保护试验，每组12只1日龄SPF鸡肌肉注射接种106EID50剂量，3周后以105EID50剂量基因VII型ZJ1毒株进行点眼、滴鼻攻毒，结果表明，免疫鸡抗体HI效价以本专利技术的毒株组最高，3周龄时平均达到6.0±0.6，显著高于LaSota株和V4株，攻毒保护率本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株，是新城疫病毒基因Ⅷ型NDV/rAHR09(Newcastle DiseaseVirus，NDV/rAHR09)，它的保藏号为CCTCC NO：V201739。

【技术特征摘要】
1.一种热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株，是新城疫病毒基因Ⅷ型NDV/rAHR09(NewcastleDiseaseVirus，NDV/rAHR09)，它的保藏号为CCTCCNO：V201739。2.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹永忠，吴艳涛，张小荣，刘倩，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32