一种耐重金属微生物的筛选方法技术

一种耐重金属微生物的筛选方法，其特征在于：依次包括以下步骤：配制缓冲溶液，向所述缓冲溶液中加入重金属盐溶液，再配制成不同浓度梯度的含有重金属离子的缓冲液，过滤灭菌后备用，其中，缓冲溶液为中性无机盐缓冲溶液；将含有重金属离子的缓冲液与环境样品混合，制备成环境样品悬浊液，混匀后在20~40℃恒温条件下培养0.5~5小时，让环境样品中的微生物接受重金属离子浸泡筛选；完成浸泡后对环境样品悬浊液进行梯度稀释得到稀释液，将稀释液转接于不含重金属离子的培养基中，再培养得到稳定的耐重金属微生物。本发明专利技术的方法具有快速、简便，对培养基无干扰，无选择性，对耐重金属微生物识别率高，对非耐重金属微生物敏感的特点。

A Screening Method for Heavy Metal Resistant Microorganisms

A method for screening microorganisms resistant to heavy metals is characterized by the following steps in turn: preparing buffer solution, adding heavy metal salt solution to the buffer solution, then preparing buffer solution containing heavy metal ions with different concentration gradients, filtering and sterilization reserve, in which the buffer solution is a neutral inorganic salt buffer solution, and adding buffer solution containing heavy metal ions to the buffer solution. Environmental samples were mixed and prepared into suspension of environmental samples. After mixing, microorganisms in environmental samples were cultured for 0.5-5 hours at 20-40 C for immersion and screening of heavy metal ions. Gradient dilution of the suspension of environmental samples was carried out after immersion, and the diluent was transferred to the medium without heavy metal ions, and then stable heavy metal-tolerant microorganisms were obtained. Biology. The method of the invention has the characteristics of fast, simple, no interference to the culture medium, no selectivity, high recognition rate to heavy metal-resistant microorganisms, and sensitivity to non-heavy metal-resistant microorganisms.

【技术实现步骤摘要】
一种耐重金属微生物的筛选方法
本专利技术属于环境微生物领域，具体涉及一种耐重金属微生物的筛选方法。
技术介绍
铬（Chromium）是现代工业极其重要的重金属原料，广泛应用在电镀，制革，染色工业，防腐和杀菌剂等领域，据估计全球每年有超过17万吨含铬产物进入环境[1]。环境中常见的铬为Cr(III)和Cr(VI)，其中Cr(III)低毒且在pH中性环境中迁移力弱，也是生物体重要的痕量元素；而Cr(VI)毒性强，易溶于水，在环境中迁移能力强，可快速渗透进生物的细胞膜，破坏细胞内的蛋白质，核酸并影响代谢过程，短期和长期接触均有致癌风险。含Cr(VI)废弃物进入环境后，极易通过食物链进入人体，因此美国环境保护署将Cr(VI)列为17种对人类威胁最大的物质之一。首次报道微生物对Cr(VI)具有耐性是在20世纪70年代后期，Romanenko和Koren’Kov从活性污泥中分离出一株Pseudomonas，其在厌氧条件下能将Cr(VI)还原为Cr(III){VI,1977#50}。目前为止许多微生物都已经被证实具有去除Cr(VI)的能力，比如细菌中的Aerococcus，Micrococcus和Aeromonas；酵母有S.cerevisiae，Rhodotorulapilimanae，Yarrowialipolytica和Hanseulapolymorpha，真菌有Trichoderma，Hypocreatawa和Paecilomyceslilacinus，代表性藻类有Chlorellaminiata和Cladophoraalbida。微生物对Cr(VI)的去除机理具有多样性，包括外排作用，还原作用（直接还原，间接还原，胞外还原，膜结合还原以及胞内还原）和吸收作用（生物吸附和生物累积）。多样的微生物类别和耐性机理为除铬应用提供了可能。马锦民等回顾微生物处理含Cr(VI)废水研究进展时发现，利用活体微生物法效果更好；牛永艳等将Cr(VI)还原菌应用于微生物燃料电池阴极处理含铬废水，Cr(VI)还原率可达68.9%；目前微生物也开始被尝试应用于肠道内铬累积的修复。与耐铬微生物开发应用的蓬勃发展相比，筛选方法研究仍然传统而滞后，几乎所有的国内外文献均是将Cr(VI)与培养基直接混合。但鉴于Cr(VI)独特的理化性质，如其具有强氧化性，可产生络合作用等，微生物培养基与Cr(VI)必然存在有效性的互相影响。郭丽艳等指出有机质类和无机酸对Cr(VI)的特征吸收峰的位置和吸收强度均有不同程度的影响，而无机盐类对其影响较小；成分复杂的培养基较低碳源组分培养基更易降低重金属离子的有效性，并对重金属离子对微生物毒性的评价产生影响；Tanu等研究表明，SWM培养基和mVB培养基在不接种的情况下在72小时内分别对六价铬具有20%和40%的还原能力，而mM63培养基在不接种的情况下未表现出对六价铬的还原能力。因此传统将Cr(VI)与培养基混合的方法使用场景局限，在简单或无机盐培养基中使用情况较好。但在复杂培养基，特别是多种碳源或含还原性物质培养基中，存在很多问题，例如，容易导致培养基中Cr(VI)浓度不达标，Cr(VI)真实浓度小；培养基中Cr(VI)形态可能会发生变化，Cr(VI)可能会被培养基成分还原；培养基组分容易被破坏。上述问题都会导致出现筛选出的耐Cr(VI)菌种出现假阳性或假阴性情况。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种耐重金属微生物的筛选方法，本专利技术的方法能快速、简便、有效筛选出耐重金属微生物，并避免培养基的干扰。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种耐重金属微生物的筛选方法，依次包括以下步骤：第一步，缓冲体系的建立：配制缓冲溶液，向所述缓冲溶液中加入重金属盐溶液，再配制成不同浓度梯度的含有重金属离子的缓冲液，过滤灭菌后备用，其中，所述缓冲溶液为pH在7.0-8.0的中性无机盐缓冲溶液；第二步，利用缓冲体系原位筛选耐重金属微生物活体细胞：将所述含有重金属离子的缓冲液与环境样品混合，制备成环境样品悬浊液，混匀后在20~40℃恒温条件下培养0.5~5小时，让所述环境样品中的微生物接受重金属离子浸泡筛选，不耐重金属微生物在第二步中会细胞死亡；第三步，耐重金属微生物活体细胞的分离及再培养：完成浸泡后对所述环境样品悬浊液进行梯度稀释得到稀释液，将所述稀释液转接于不含重金属离子的培养基中，通过在培养基进行再培养得到稳定的耐重金属微生物。优选地，在所述第一步中，所述缓冲溶液为磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液以及硼酸-硼砂缓冲液中的任意一种。更优选地，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。优选地，在所述第一步中，所述重金属盐溶液为铬盐溶液、铜盐溶液、铁盐溶液、镉盐溶液以及锰盐溶液中的任意一种。优选地，在所述第二步中，所述环境样品为土壤、活性污泥、畜禽粪便、堆肥以及淤泥中的任意一种。环境样品中天然的含有数量很大、种类繁多的微生物。上述环境样品相当于微生物的“天然仓库”。优选地，在所述第二步中，所述含有重金属离子的缓冲液与环境样品的推荐重量比例为1:5~1:10，本领域技术人员可根据实际需要调整缓冲液与环境样品的比例。优选地，在所述第三步中，所述培养基为含有还原糖或还原物质的微生物培养基。所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、高氏1号培养基、马丁氏培养基、马铃薯培养基、察氏培养基、麦氏培养基以及葡萄糖蛋白胨培养基中的任意一种。含有还原糖或还原物质的微生物培养基的种类繁多，本领域技术人员可根据实际需要选择所需的培养基，不仅限于上述提到的培养基种类。本专利技术设计构思是：针对传统筛选方法培养基与重金属离子易相互作用的问题，本专利技术提出一种利用含有重金属的缓冲液浸泡筛选耐重金属微生物的新方法，核心点在于将目标微生物提前接受不同浓度重金属离子浸泡，筛选出耐重金属的微生物细胞，然后通过在不含重金属离子的培养基上后续扩繁。也就是说，将重金属离子与微生物的接触过程和微生物的培养过程分离，从而避免重金属离子与培养基的互相作用。本专利技术的积极效果在于：（1）本专利技术仅在含有重金属离子的缓冲液中提前浸泡筛选耐重金属微生物，能够保证缓冲液中加入的重金属离子的真实浓度准确、可靠；（2）本专利技术不向培养基中加入重金属离子，可以保证培养基成分不受重金属离子的影响和破坏；（3）本专利技术仅在缓冲液中加入重金属离子，所加入的重金属离子的浓度可不受限制，可操作空间更大，可根据实际需要控制重金属离子浓度；而传统的筛选方法需要在培养基中加入重金属离子，如培养基中重金属离子浓度过高，则会破坏培养基成分；（4）本专利技术能够避免所筛选出的耐重金属菌种出现假阳性或假阴性情况；（5）利用本专利技术的方法分离出的微生物种类数多，微生物的多样性好。总之，本专利技术的方法具有快速、简便，对培养基无干扰，无选择性，对耐重金属微生物识别率高，对非耐重金属微生物敏感的特点。利用本专利技术方法分离的微生物包括Stenotrophomonas,Chlorella,Paecilomyce,Staphylococcus,Candidautilis等。附图说明附图1为实施例1的利用磷酸-Cr(VI)缓冲液浸泡筛选耐Cr(VI)微生物流程图；附图2为实施例1的磷酸-Cr(VI)缓冲液浸泡后3种纯菌株后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耐重金属微生物的筛选方法，其特征在于：依次包括以下步骤：第一步，缓冲体系的建立：配制缓冲溶液，向所述缓冲溶液中加入重金属盐溶液，再配制成不同浓度梯度的含有重金属离子的缓冲液，过滤灭菌后备用，其中，所述缓冲溶液为pH在7.0‑8.0的中性无机盐缓冲溶液；第二步，利用缓冲体系原位筛选耐重金属微生物活体细胞：将所述含有重金属离子的缓冲液与环境样品混合，制备成环境样品悬浊液，混匀后在20~40℃恒温条件下培养0.5~5小时，让所述环境样品中的微生物接受重金属离子浸泡筛选；第三步，耐重金属微生物活体细胞的分离及再培养：完成浸泡后对所述环境样品悬浊液进行梯度稀释得到稀释液，将所述稀释液转接于不含重金属离子的培养基中，通过在培养基进行再培养得到稳定的耐重金属微生物。

【技术特征摘要】
1.一种耐重金属微生物的筛选方法，其特征在于：依次包括以下步骤：第一步，缓冲体系的建立：配制缓冲溶液，向所述缓冲溶液中加入重金属盐溶液，再配制成不同浓度梯度的含有重金属离子的缓冲液，过滤灭菌后备用，其中，所述缓冲溶液为pH在7.0-8.0的中性无机盐缓冲溶液；第二步，利用缓冲体系原位筛选耐重金属微生物活体细胞：将所述含有重金属离子的缓冲液与环境样品混合，制备成环境样品悬浊液，混匀后在20~40℃恒温条件下培养0.5~5小时，让所述环境样品中的微生物接受重金属离子浸泡筛选；第三步，耐重金属微生物活体细胞的分离及再培养：完成浸泡后对所述环境样品悬浊液进行梯度稀释得到稀释液，将所述稀释液转接于不含重金属离子的培养基中，通过在培养基进行再培养得到稳定的耐重金属微生物。2.根据权利要求1所述的一种耐重金属微生物的筛选方法，其特征在于：在所述第一步中，所述缓冲溶液为磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液以...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅丽娟，施林林，殷士学，
申请(专利权)人：苏州市农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32