从滇山茶中提取黄酮类化合物的方法技术

本发明专利技术提供了一种从滇山茶中提取黄酮类化合物的方法。所述方法为:将滇山茶茶饼浸提得提取液，减压蒸馏得到浓缩液；加入大孔树脂层析柱，用水、20％乙醇、50％乙醇、80％乙醇进行梯度洗脱，收集洗脱液得粗流份段；将粗流份段加入RP‑C18填料层析柱，用乙腈‑甲酸水溶液体系进行梯度洗脱，减压浓缩、干燥得到粗分离物；使用C18色谱柱、甲醇‑甲酸水溶液体系作为流动相，将粗分离物用溶剂溶解后进样进行梯度洗脱，浓缩冻干得预分离物；使用C18色谱柱、用乙腈‑甲酸水溶液作为流动相，预分离物用溶剂溶解后进样进行等度洗脱，浓缩冻干得到目标化合物。本申请提供的方法，首次从山茶属植物中分离出目标化合物，提取纯度高。

Extraction of Flavonoids from Camellia yunnanensis

The invention provides a method for extracting flavonoids from Camellia yunnanensis. The method is as follows: extracting the tea cake from Yunnan Mountain by vacuum distillation to obtain concentrated solution; adding macroporous resin column, gradient elution with water, 20% ethanol, 50% ethanol and 80% ethanol, collecting the eluent to obtain the crude flow section; adding the crude flow section to RP C18 packed column, gradient elution with acetonitrile-formic acid aqueous solution system, vacuum concentration and drying to obtain crude flow section. Separate; use C18 column, methanol-formic acid aqueous solution system as mobile phase, dissolve the crude separation with solvent, then inject the sample for gradient elution, concentrate and freeze-dry to obtain the pre-separation; use C18 column, acetonitrile-formic acid aqueous solution as mobile phase, the pre-separation is dissolved with solvent, then inject the sample for isometric elution, concentrate and freeze-dry to obtain the target compound. The method provided in this application is the first time to isolate target compounds from Camellia plants with high purity.

【技术实现步骤摘要】
从滇山茶中提取黄酮类化合物的方法
本专利技术涉及化合物提取领域，具体而言，涉及一种从滇山茶中提取黄酮类化合物的方法。
技术介绍
滇山茶(CamelliareticulataLindl.)又名滇茶或腾冲红花油茶，山茶科(Theaceae)山茶属(CamelliaL.)多年生常绿乔木，是中国特有物种、国家二级重点保护植物。我国作为油茶的原产地，已有2300多年的栽培历史，云南省是我国的油茶大省，具有丰富的油茶资源。油茶多用来榨油，一般来说，油茶籽中油酸、亚油酸等脂肪酸的含量是评定油茶品质的重要指标。滇山茶与普通的油茶相比，含油量高、油体透亮，不饱和脂肪酸含量高达83.5％。滇山茶含有丰富的生物活性物质，如黄酮、有机酸、皂苷、三萜类化合物等，这些化合物有一定的营养保健功效，能降低胆固醇、预防肿瘤、增强机体免疫力，具有很好的生物利用价值。山奈酚及其衍生物是油茶中一类重要的化合物，具有抗癌、治疗糖尿病和骨质疏松以及保护损伤细胞等功能。现有技术对于滇山茶中所含有的活性物质分析不全面，很多有效成分有待分离提取。将滇山茶中的有效活性物质从复杂多样的成分中分离提取出来，得到纯度较高的产品，对于滇山茶的深度应用具有重要的作用。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种从滇山茶中提取黄酮类化合物的方法，所述方法首次从滇山茶中提取出目标化合物，而且快速有效、纯度很高。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种从滇山茶中提取黄酮类化合物的方法，所述方法包括以下步骤:A.将滇山茶茶饼用乙醇水溶液进行超声浸提，得到提取液；将所述提取液减压蒸馏至无醇得到浓缩液；B.将所述浓缩液加入大孔树脂层析柱，依次用水、20％乙醇、50％乙醇、80％乙醇进行梯度洗脱，经色谱检测，收集含有目标提取物的洗脱液得粗流份段；C.将所述粗流份段加入RP-C18填料层析柱，用乙腈-甲酸水溶液体系进行梯度洗脱，经色谱检测，收集含有目标提取物的洗脱液得准流份段；减压浓缩、干燥得到粗分离物；D.使用第一C18色谱柱、用甲醇-甲酸水溶液体系作为流动相，将所述粗分离物用第一溶剂溶解后进样，进行等度洗脱，收集含有目标化合物的流份段，浓缩冻干得到预分离物；E.使用第二C18色谱柱、用乙腈-甲酸水溶液作为流动相，将所述预分离物用第二溶剂溶解后进样，进行等度洗脱，收集含有目标化合物的流份段，浓缩冻干得到目标化合物，所述目标化合物的结构式为：通过浸提-浓缩-大孔树脂柱层析-RP-C18柱层析-C18色谱柱高效液相色谱制备-C18色谱柱高效液相色谱再次制备的方法，可以有效的将目标化合物从滇山茶众多的成分中分离提取出来，提取得率大于14.6mg/kg，纯度高于97.2％。优选地，所述大孔树脂层析柱中的大孔树脂的型号为D101，粒径60-16目、比表面积≥550m2/g、比照吸附量(酚/干基)≥20mg/g；所述大孔树脂使用前需用乙醇洗脱至颜色清亮，再用纯水洗脱至无醇味。大孔树脂型号和参数的选择，是基于滇山茶中不同成分的极性以及彼此之间的差异、通过设计试验来确定的。对大孔树脂进行预处理，有利于保证大孔树脂对分离成分的有效吸附，保证柱层析按照理论分析的目标顺利进行，提高分离效率。优选地，所述步骤B中，所述大孔树脂层析柱的柱体积为2L；每500mL收集一次洗脱液并顺次标号，所述粗流份段由第A26-28号洗脱液合并得到。限定柱体积和收集洗脱液的时机，是为了在有效分离的基础上最大程度的收集目标化合物，从而提高分离效率、最终的提取得率和纯度。优选地，所述RP-C18填料层析柱的制备方法为：取RP-C18填料加入乙醇溶液进行超声，去除多余气泡后装入层析柱中。更加优选地，所述步骤C中，所述乙腈-甲酸水溶液体系为：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数0.1％的甲酸水溶液；洗脱梯度配比为：流动相A与流动相B的体积比依次为17：83、30：70、40：60、100：0，每个洗脱梯度洗脱至无色为止。进一步优选地，所述步骤C中，所述RP-C18填料层析柱的柱体积为1.2L；每200mL收集一次洗脱液并顺次标号，所述准流份段由第B22-25号洗脱液合并得到。层析柱类型、流动相及其比例、洗脱梯度、收集选取时机是基于粗流份段中所包含的物质的极性、分离时间、分离度等参数来确定。合适的流动相及其比例、洗脱梯度，可以快速有效地将目标化合物初步分离出来。优选地，所述步骤D中，所述第一C18色谱柱的规格为：VenusilMPC18，尺寸10mm×250mm，填料粒径为5微米；所述甲醇-甲酸水溶液体系为：流动相C为甲醇，流动相D为体积分数0.1％的甲酸水溶液；其洗脱配比为：所述流动相C与所述流动相D的体积比为50：50。色谱柱的参数选择、流动相体系的选取、洗脱配比的选取，都是为了更好的获得目标化合物。这些参数彼此之间互相影响，最终决定整个方法对目标提取物的分离纯化结果。更加优选地，所述步骤E中，所述第二C18色谱柱的规格为：VenusilMPC18，尺寸10mm×250mm，填料粒径为5微米；所述乙腈-甲酸水溶液体系为：流动相E为乙腈，流动相F为体积分数0.1％的甲酸水溶液，其洗脱配比为：所述流动相E与所述流动相F的体积比为23：77。可选地，所述滇山茶茶饼的制作方法为：将滇山茶茶果晾干、去壳，以冷榨法脱去油脂后晾干，粉碎即可；所述乙醇水溶液的体积分数为50-60％；所述浸提的方法为：料液比为1kg所述滇山茶茶饼对应3-4L所述乙醇水溶液，在30-40℃条件下超声浸提2-4次，过滤得到所述提取液。去壳、脱去油脂，是为了最大程度的保证提取得率，减少分离过程中的干扰。合适的原料处理方法还有利于避免目标化合物的流失。恰当的浸提溶剂和浸提方法，可以保证提取得率。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)首次从山茶属植物中发现并分离出了目标提取物；(2)本申请提供的提取方法简单、有效，适合于推广应用。(3)目标化合物提取纯度高。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为实施例1对粗分离物进行制备的HPLC谱图；图2为实施例1对预分离物进行制备的HPLC谱图；图3为实施例1制备得到的目标化合物的纯度测定图；图4为本申请制备得到的目标化合物的质谱图；图5为本申请制备得到的目标化合物的H谱图；图6为本申请制备得到的目标化合物的C谱图；图7为本申请制备得到的目标化合物的H-HCOSY谱图；图8为本申请制备得到的目标化合物的HSQC谱图；图9为本申请制备得到的目标化合物的HMBC谱图；图10为本申请制备得到的目标化合物的TOCSY谱图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1将滇山茶的茶果晾晒，去壳，以冷榨法脱去油脂后晾干并适当粉碎，即得到滇山茶茶饼。以体积分数为50％的乙醇水溶液于40℃条件下超声浸提3次，每次6h，料液比为1:4(m/v)，然后进行过滤、合并，得到提取液。将提取液减压本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从滇山茶中提取黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:A.将滇山茶茶饼用乙醇水溶液进行超声浸提，得到提取液；将所述提取液减压蒸馏至无醇得到浓缩液；B.将所述浓缩液加入大孔树脂层析柱，依次用水、20％乙醇、50％乙醇、80％乙醇进行梯度洗脱，经色谱检测，收集含有目标提取物的洗脱液得粗流份段；C.将所述粗流份段加入RP‑C18填料层析柱，用乙腈‑甲酸水溶液体系进行梯度洗脱，经色谱检测，收集含有目标提取物的洗脱液得准流份段；减压浓缩、干燥得到粗分离物；D.使用第一C18色谱柱、用甲醇‑甲酸水溶液体系作为流动相，将所述粗分离物用第一溶剂溶解后进样，进行等度洗脱，收集含有目标化合物的流份段，浓缩冻干得到预分离物；E.使用第二C18色谱柱、用乙腈‑甲酸水溶液作为流动相，将所述预分离物用第二溶剂溶解后进样，进行等度洗脱，收集含有目标化合物的流份段，浓缩冻干得到目标化合物，所述目标化合物的结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种从滇山茶中提取黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:A.将滇山茶茶饼用乙醇水溶液进行超声浸提，得到提取液；将所述提取液减压蒸馏至无醇得到浓缩液；B.将所述浓缩液加入大孔树脂层析柱，依次用水、20％乙醇、50％乙醇、80％乙醇进行梯度洗脱，经色谱检测，收集含有目标提取物的洗脱液得粗流份段；C.将所述粗流份段加入RP-C18填料层析柱，用乙腈-甲酸水溶液体系进行梯度洗脱，经色谱检测，收集含有目标提取物的洗脱液得准流份段；减压浓缩、干燥得到粗分离物；D.使用第一C18色谱柱、用甲醇-甲酸水溶液体系作为流动相，将所述粗分离物用第一溶剂溶解后进样，进行等度洗脱，收集含有目标化合物的流份段，浓缩冻干得到预分离物；E.使用第二C18色谱柱、用乙腈-甲酸水溶液作为流动相，将所述预分离物用第二溶剂溶解后进样，进行等度洗脱，收集含有目标化合物的流份段，浓缩冻干得到目标化合物，所述目标化合物的结构式为：2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔树脂层析柱中的大孔树脂的型号为D101，粒径60-16目、比表面积≥550m2/g、比照吸附量(酚/干基)≥20mg/g；所述大孔树脂使用前需用乙醇洗脱至颜色清亮，再用纯水洗脱至无醇味。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤B中，所述大孔树脂层析柱的柱体积为2L；每500mL收集一次洗脱液并顺次标号，所述粗流份段由第A26-28号洗脱液合并得到。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RP-C18填料层析柱的制备方法为：取RP-C18填料加入乙醇溶液进行超声，去除多余气泡后装入层析柱中。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤C中，所述乙腈-甲酸水溶液体系为：流...

【专利技术属性】
技术研发人员：王蔚婕，曹清明，胡丹丹，包莉圆，周文化，
申请(专利权)人：中南林业科技大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43