一种核桃多酚的制备工艺及其神经保护用途制造技术

本发明专利技术属于天然产物资源开发利用领域，提供了一种核桃多酚的提取方法及其神经保护用途。该提取方法是以抗氧化和神经保护作用为导向建立的，具体：将核桃仁用石油醚脱脂后，采用乙醇溶液室温下浸提得粗多酚，萃取其乙酸乙酯部位，采用NKA‑9树脂分离纯化，并进一步采用HP‑20分离纯化得到核桃多酚。本发明专利技术提供的提取方法得到的核桃多酚主要包含含有六羟基联苯酰(HHDP)基团的化合物，对于氧化应激和Aβ蛋白沉积的损伤具有很好的神经保护作用，可用于抗衰老和神经保护作用的药物或保健品的开发。

Preparation of a Walnut Polyphenol and Its Neuroprotective Uses

The invention belongs to the field of natural product resources development and utilization, and provides a walnut polyphenol extraction method and its neuroprotective use. The extraction method is based on antioxidant and neuroprotective effects. Specifically, after degreasing walnut kernels with petroleum ether, the crude polyphenols are extracted by ethanol solution at room temperature, the ethyl acetate fraction is extracted, the walnut polyphenols are separated and purified by NKA_9 resin, and further separated and purified by HP_20. The walnut polyphenols obtained by the extraction method of the present invention mainly contain compounds containing hexahydroxybenzoyl (HHDP) groups, which have good neuroprotective effects on oxidative stress and deposition of beta protein, and can be used for the development of anti-aging and neuroprotective drugs or health products.

【技术实现步骤摘要】
一种核桃多酚的制备工艺及其神经保护用途
本专利技术属于天然产物资源开发利用领域，涉及一种核桃多酚的提取方法及其神经保护用途。
技术介绍
据统计，目前全球痴呆患者大约为3.65亿，每年新增0.77亿。在我国，早老性痴呆即阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)在65岁以上人群中的患病率约为3％～5％，且每年以8％的速率增长。AD已成为老年人致残致死最严重的疾病之一，AD的高发严重影响了老年人的生活质量，并且给家庭和社会带来巨大的心理和经济负担。因此研制安全有效的抗脑老化及AD的营养补充剂具有重要的现实意义。大脑衰老及相关神经退行性疾病病理机制复杂，至今不明，其中氧化应激和β淀粉样蛋白(amyloidbeta，Aβ)沉积是公认的脑衰老和AD发生发展的重要病因。因此，能够降低神经系统氧化应激损伤或Aβ损伤被认为是防治脑老化及相关神经退行性疾病的重要策略。核桃自古以来就被认为是健脑益智的佳品，在美洲、欧洲被称为“益智果”，在我国有“长寿果”的美誉。现代医学与营养学研究证实，核桃具有益智(促进学习记忆)的功效，经常食用核桃可降低神经退行性疾病的患病风险，并可延缓衰老相关的认知功能障碍。大量研究表明核桃多酚是核桃益智及防治脑老化的重要功效组分，核桃多酚约占核桃总重的5％左右，种类多达120种，以鞣花酸，鞣酸单宁及黄酮类成分为主。然而目前的研究只限于对核桃多酚粗提物的功效研究，以活性为导向的制备工艺及其有效成分的分析研究未见报道，限制了核桃多酚相关药物和保健品等产品的开发。
技术实现思路
针对上述未解决问题，本专利技术的目的在于提供一种核桃多酚的提取方法及其神经保护用途，用于缓解衰老相关的氧化应激和Aβ沉积性神经损伤。该提取方法是以抗氧化和神经保护活性评价为导向建立的，并分析该提取方法得到的核桃多酚的组成，为核桃多酚相关功能产品的开发提供科学的实验数据，为阐明其神经保护作用的物质基础提供理论依据。为实现上述目的，同时考虑核桃多酚的药品和食品相关用途，本专利技术提供了一种核桃多酚的提取方法，该提取方法包括以下步骤：步骤A将去壳的核桃仁粉碎，按料液比1∶3加入石油醚，在室温下持续搅拌浸提6h后，弃滤液，重复三次去除油脂；步骤B将脱脂后的核桃仁粕按料液比1∶5加入75％乙醇溶液，在室温(25℃)下持续搅拌浸提6h，抽滤取滤液，重复三次，将三次得到的提取液合并在45℃下旋蒸浓缩得到核桃粗多酚；步骤C将粗多酚和乙酸乙酯按1∶1混合萃取，第一次萃取12h，后两次萃4h，将三次萃取液合并在45℃下旋蒸得到乙酸乙酯部位浓缩液；步骤D采用极性树脂NKA-9对步骤C得到浓缩液进行进一步的纯化和分离。树脂预处理和装柱后用速率为1ml/min将浓度为3mg/ml的核桃多酚极性部位进行上样，用流速为0.5ml/min的50％乙醇进行洗脱，洗脱3次合并洗脱液；步骤E相同方法采用中等极性树脂HP-20对步骤D中得到乙醇洗脱物先进行75％乙醇洗脱，洗脱至少3次，然后采用100％乙醇洗脱3次，收集合并100％乙醇洗脱物于45℃下旋蒸浓缩干燥得核桃多酚。本专利技术提供了一种核桃多酚的提取方法，该提取方法是以体外抗氧化活性包括DPPH、ABTS和FRAP试验和细胞水平神经保护活性包括抗H2O2和Aβ诱导的的类神经细胞人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞损伤为导向的，可以获得具有更高活性的核桃多酚。本专利技术还提供了核桃多酚的神经保护用途，采用MTT法分别检测核桃多酚对H2O2和Aβ诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有明显的保护作用(测定细胞活力)，并采用DCFH-DA法检测核桃多酚显著降低H2O2诱导的细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)水平升高，发挥显著的细胞保护作用，对衰老相关的氧化应激和Aβ蛋白沉积性损伤发挥神经保护作用。本专利技术还提供了根据上述方法提取得到的核桃多酚，提供了该核桃多酚的组成分析。采用液质联用(LC-MS)分析活性组分主要含有花梗鞣素/木麻黄鞣质异构体、trictinin/isostrictininisomers、TellimagrandinIisomer、木麻黄鞣宁异构体、Strictinin/isostrictininisomers、三聚乙酰-葡萄糖、四聚乙酰-葡萄糖、原花青素、Valoneicaciddilactone/sanguisorbicaciddilactoneisomer、槲皮素戊糖苷异构体和鞣花酸等11种物质，这些化合物除原花青素外均含有六羟基联苯酰(HHDP)基团。附图说明图1没食子酸标准曲线图2不同浓度的H2O2对SH-SY5Y细胞的损伤作用.柱状图代表各组均值±标准差，n＝4。**P＜0.01，与对照组比较图3核桃多酚不同极性部位对H2O2损伤细胞的保护作用.柱状图代表各组均值±标准差，n＝4。##P＜0.01，与对照组比较；**P＜0.01，与模型组比较，粗多酚(WCP)，乙酸乙酯部位(EAW)，正丁醇部位(NW)，水层部位(WFW)图4核桃多酚NKA-9树脂纯化部位对H2O2损伤SH-SY5Y细胞的保护作用.0EAW，25％EAW，50％EAW和75％EAW分别指核桃多酚乙酸乙酯部位经NKA-9树脂纯化0，25％，50％和75％乙醇洗脱物.柱状图代表各组均值±标准差，n＝4。##P＜0.01，与对照组比较；**P＜0.01，与模型组比较.图5核桃多酚HP-20树脂纯化部位对H2O2损伤SH-SY5Y细胞的保护作用.0EAW，25％EAW，50％EAW，75％EAW和100％EAW分别指经HP-20树脂纯化0，25％，50％，75％和100％乙醇洗脱物.柱状图代表各组均值±标准差，n＝4。##P＜0.01，与对照组比较；*P＜0.05、**P＜0.01，与模型组比较.图6核桃多酚多个有效部位对H2O2损伤细胞的保护作用.WCP：粗多酚，EAW：乙酸乙酯部位，EAW1：经NKA-9树脂纯化的50％乙醇洗脱物，EAW2：经HP-20树脂纯化100％乙醇洗脱物.柱状图代表各组均值±标准差，n＝4。##P＜0.01，与对照组比较；**P＜0.01，与模型组比较图7核桃多酚多个有效部位对H2O2损伤模型细胞内ROS的影响.WCP：粗多酚，EAW：乙酸乙酯部位，EAW1：经NKA-9树脂纯化的50％乙醇洗脱物，EAW2：经HP-20树脂纯化100％乙醇洗脱物.柱状图代表各组均值±标准差，n＝4。##P＜0.01，与对照组比较；**P＜0.01，与模型组比较.图8不同浓度的Aβ对SH-SY5Y细胞的损伤作用.柱状图代表各组均值±标准差，n＝4.**P＜0.01，与对照组比较图9核桃多酚不同极性部位对Aβ损伤细胞的保护作用.柱状图代表各组均值±标准差，n＝4。##P＜0.01，与对照组比较；**P＜0.01，与模型组比较，粗多酚(WCP)，乙酸乙酯部位(EAW)，正丁醇部位(NW)，水层部位(WFW).图10核桃多酚NKA-9树脂纯化部位对Aβ损伤SH-SY5Y细胞的保护作用.0EAW，25％EAW，50％EAW和75％EAW分别指核桃多酚乙酸乙酯部位经NKA-9树脂纯化0，25％，50％和75％乙醇洗脱物.柱状图代表各组均值±标准差，n＝4。##P＜0.01，与对照组比较；**P＜0.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核桃多酚的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤A将去壳的核桃仁粉碎，采用石油醚脱脂；步骤B采用乙醇溶液将脱脂后的核桃仁粕在室温下浸提得粗多酚；步骤C萃取粗多酚的乙酸乙酯部位；步骤D采用极性树脂对步骤C得到的浓缩液进行分离和纯化；步骤E采用中等极性树脂对步骤D中得到乙醇洗脱物进行进一步分离纯化得到核桃多酚。

【技术特征摘要】
1.一种核桃多酚的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤A将去壳的核桃仁粉碎，采用石油醚脱脂；步骤B采用乙醇溶液将脱脂后的核桃仁粕在室温下浸提得粗多酚；步骤C萃取粗多酚的乙酸乙酯部位；步骤D采用极性树脂对步骤C得到的浓缩液进行分离和纯化；步骤E采用中等极性树脂对步骤D中得到乙醇洗脱物进行进一步分离纯化得到核桃多酚。2.根据权利要求1所述的核桃多酚的提取方法，其特征在于，所述步骤A中，石油醚脱脂温度为20℃～30℃。3.根据权利要求1所述的核桃多酚的提取方法，其特征在于，所述步骤B中，提取温度为20℃～30℃。4.根据权利要求1所述的核桃多酚的提取方法，其特征在于，所述步骤D中的极性树脂为NKA-9。5.根据权利要求1所述的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：安磊，任虹，王友升，黄小龙，张维，孙雨辰，孟迪，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：北京,11