一种苹果酸脱氢酶突变基因、构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种苹果酸脱氢酶突变基因、构建方法及其应用，属于生物基因工程技术领域，突变苹果酸脱氢酶基因以天蓝色链霉菌苹果酸脱氢酶为模板通过引物设计，分步PCR，融合PCR，转化菌抗性筛选，核苷酸测序的基因工程的手段构建能够表达苹果酸脱氢酶的基因序列，将构建的苹果酸脱氢酶转到大肠杆菌DE3菌株中进行表达，本发明专利技术表达的苹果酸脱氢酶，具有比样本野生型表达的苹果酸脱氢酶活性高两倍以上的特性，为D‑苹果酸的生产提供更高效的拆分和纯化用酶。

A Malate Dehydrogenase Mutant Gene, Construction Method and Its Application

The invention discloses a malic dehydrogenase mutant gene, construction method and application, belonging to the field of biogenetic engineering technology. The mutant malic dehydrogenase gene is constructed by genetic engineering means that can express malic dehydrogenase through primer design, step-by-step PCR, fusion PCR, resistance screening of transforming bacteria and nucleotide sequencing using Streptomyces cereus malic dehydrogenase as template. The malic dehydrogenase expressed in the present invention has the characteristics that the malic dehydrogenase activity expressed in the wild type of samples is more than twice as high as that expressed in the wild type of samples, thus providing more efficient enzymes for the separation and purification of D - malic acid.

【技术实现步骤摘要】
一种苹果酸脱氢酶突变基因、构建方法及其应用
本专利技术涉及生物基因工程
，特别是指一种苹果酸脱氢酶突变基因、构建方法及其应用。
技术介绍
在自然状态下苹果酸(2-羟基丁二酸)因为分子中有一个手性碳原子所以有3种存在形式，即D-苹果酸、L-苹果酸、DL-苹果酸。L-苹果酸是生物体内柠檬酸循环代谢的成分之一，因较易被人体代谢吸收，故广泛应用在食品、制药、化工等领域。而D-苹果酸则是一种自然界中稀少的有机酸。D-苹果酸因其特殊的手性常常被用来作为药物中的手性源，主要应用在手性药物合成、手性添加剂、手性助剂等领域，例如抗生素、药物信息素、抗病毒药物、抗癌药物、抗组胺药D-和L-肉毒碱等合成，也可作为药物拆分剂和不对称合成的配体。D-苹果酸生产方法主要有三种，化学和生物拆分法以及生物转化法(酶法)等。但是化学拆分法成本高，生物拆分法由于D-苹果酸对菌体的生长有抑制作用，无法生产得到浓度较高的D-苹果酸。在生物转化法的研究中存在马来酸水合酶活性低，稳定性差、不耐盐、转化率低等问题。而且在D-苹果酸的生产中常常会混有L-苹果酸和DL-苹果酸，导致提纯的过程中常常难以做到完全除去L-苹果酸，因此需要提出一种高效的处理方式—酶处理法。使用苹果酸脱氢酶专一性分解L-苹果酸能够有效的对外消旋物起到一个拆分和提纯的效果。苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase,MDH)(EC1.1.1.37)存在于所有生物体中，是生物糖代谢的关键酶之一，它可以实现苹果酸和草酰乙酸间的可逆转换。野生型MDH在体外表达很难具有较高的催化活性，但是经过筛选也可以寻找到具有应用潜力的MDH，例如近几年报道的来自嗜热古细菌(Pyrobaculumcalidifontis)的苹果酸脱氢酶具有极高的催化活性(886U/mg)。在自然状态下筛选拥有高活性的野生型苹果酸脱氢酶耗时较长，工序繁琐，不利于获得高活性的苹果酸脱氢酶以实现D/L-苹果酸的拆分，以及其他合成方法后的D-苹果酸的提纯。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种苹果酸脱氢酶突变基因、构建方法及其应用，用于克服上述现有技术中的全部或者部分不足。基于上述目的本专利技术提供的一种苹果酸脱氢酶突变基因，该突变基因具有SEQIDNO.1的碱基序列。一种苹果酸脱氢酶突变基因的构建方法，包括如下步骤：引物设计，突变型重组质粒的构建，转化筛选，核苷酸测序。可选的，所述引物设计是根据天蓝色链霉菌苹果酸脱氢酶基因序列和pET-28b(+)特征，借助Primerpremier5.0软件设计出突变引物，其中，突变引物包括如下引物：1)包括一个NdeI位点的MDHA引物，P1:5′-AAATGTGCATATGATGGTGTGCGAATACAAGCCTG-3′；NdeIP2:5′-CTTGAGCGCCCGGGTGATCTCCAGGAGGCGCAGCTTGACC-3′；2)包含一个XhoI位点的MDHB片段引物，P3:5′-AGATCACCCGGGCGCTCAAGGCCGCCGAGGGCACCGCGATGGAGCTAA-3′；P4:5′-CGCCCCTCGAGTCAGATGAGGCCGAGACCGCGC-3′。XhoI可选的，所述突变型重组质粒的构建是以天蓝色链霉菌苹果酸脱氢酶基因序列为模板，利用碱基定点突变技术，得到含突变位点的目的基因片段，目的基因片段与载体pET-28b同时双酶切后通过T4DNA连接酶连接，得到的突变重组表达质粒pET-28b-MDH。可选的，转化筛选是将突变重组质粒pET-28b-MDH转化到EscherichiacoliDH5α感受态细胞中，经过卡那霉素抗性筛选后，提取质粒、测序，得苹果酸脱氢酶的突变表达质粒pET-28b-MDH。可选的，所述碱基定点突变技术包括PCR扩增和融合扩增。可选的，所述PCR扩增条件为：8℃预变性1.5min；98℃20s，65℃25s，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min。可选的，所述融合扩增条件为：98℃预变性1.5min；98℃20s，55℃30s，72℃1.8min，30个循环；72℃延伸5min。一种苹果酸脱氢酶突变基因的用途，所述突变基因表达的苹果酸脱氢酶应用在工业上生产D-苹果酸。从上面所述可以看出，本专利技术提供的一种苹果酸脱氢酶突变基因、构建方法及其应用，本苹果酸脱氢酶突变基因以天蓝色链霉菌苹果酸脱氢酶为模板通过引物设计，分步PCR，融合PCR，转化菌抗性筛选，核苷酸测序的基因工程的手段构建能够表达苹果酸脱氢酶的基因序列，将构建的苹果酸脱氢酶转到大肠杆菌DE3菌株中进行表达，本专利技术表达的苹果酸脱氢酶，具有比样本野生型表达的苹果酸脱氢酶活性高两倍以上的特性，为D-苹果酸的生产提供更高效的拆分和纯化用酶。附图说明图1为本专利技术实施例融合片段的PCR扩增结果(T1)图；M、100bpMarker，1、融合片段A(730bp)，2、融合片段B(864bp)，3、A和B融合(1594bp)；图2为本专利技术实施例融合片段的NdeⅠ和XhoⅠ双酶切结果(T1)图；M、100bpMarker，1、融合片段双酶切；图3为本专利技术实施例突变型和野生型ScMDH的SDS-PAGE分析图；M、蛋白质分子量标准，1～2、WT和T1经0.5mMIPTG诱导后的细胞粗提物，5～6、纯化的WT和T1蛋白质；图4为本专利技术实施例突变型ScMDH重组质粒的突变构建流程。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术进一步详细说明。需要说明的是，实施例中WT：野生型；T1表示根据突变位点数量命名的突变体。1、突变位点的选择通过比对结构域相似性选择关键位点进行碱基突变。T1中将ScMDH中第46位的氨基酸残基P46替换为R(P46→R)。如表1所示：表1ScMDH的突变位点选择2、根据GenBank中天蓝色链霉菌[StreptomycescoelicolorA3(2)]MDH的基因序列(NC_003888)，用PrimerPremier5.0软件设计两对mdh突变引物(P1/P2，P3/P4)。突变流程见图4。以天蓝色链霉菌基因组DNA为模板分别扩增A(P1/P2)、B(P3/P4)两个片段：1)包括一个NdeI位点的MDHA引物，P1:5′-AAATGTGCATATGATGGTGTGCGAATACAAGCCTG-3′；NdeIP2:5′-CTTGAGCGCCCGGGTGATCTCCAGGAGGCGCAGCTTGACC-3′；2)包含一个XhoI位点的MDHB片段引物，P3:5′-AGATCACCCGGGCGCTCAAGGCCGCCGAGGGCACCGCGATGGAGCTAA-3′；P4:5′-CGCCCCTCGAGTCAGATGAGGCCGAGACCGCGC-3′。XhoI两个片段的重叠部分为引物P2、P3所在的位置，在P2、P3的5'端引入需要突变位点及序列。A、B两个片段的PCR产物经凝胶回收后，将二者等量混合后作为模板，以P1/P4为引物，扩增含有突变位点的全长ScMDH基因，凝胶检测结果如图1，图中M泳道是100bpMarker，泳道1是融合片段A(730bp)，泳道2是融合片段B(864bp)，泳道本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苹果酸脱氢酶突变基因，其特征在于，该突变基因具有SEQ ID NO.1的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.一种苹果酸脱氢酶突变基因，其特征在于，该突变基因具有SEQIDNO.1的碱基序列。2.一种苹果酸脱氢酶突变基因的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：引物设计，突变型重组质粒的构建，转化筛选，核苷酸测序。3.根据权利要求2所述的苹果酸脱氢酶突变基因的构建方法，其特征在于，所述引物设计是根据天蓝色链霉菌苹果酸脱氢酶基因序列和pET-28b(+)特征，借助Primerpremier5.0软件设计出突变引物，其中，突变引物包括如下引物：1)包括一个NdeI位点的MDHA引物，P2:5′-CTTGAGCGCCCGGGTGATCTCCAGGAGGCGCAGCTTGACC-3′；2)包含一个XhoI位点的MDHB片段引物，P3:5′-AGATCACCCGGGCGCTCAAGGCCGCCGAGGGCACCGCGATGGAGCTAA-3′；4.根据权利要求2所述的苹果酸脱氢酶突变基因的构建方法，其特征在于，所述突变型重组质粒的构建是以天蓝色链霉菌苹果酸脱氢酶基因序列为模板，利用碱基定点突变技术，得到含突变位点的目的基因片段，目的基因片段与载体pET-28...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛亚东，侯少林，蒋璐璐，苏凤智，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34