一种测定包含有柠檬酸的溶液中的透明质酸含量的方法技术

本发明专利技术提供一种测定透明质酸含量的方法，其包括：利用透明质酸酶对包含透明质酸和柠檬酸的待测样品进行酶解；使用用于分析有机酸的离子交换柱，利用不含盐的流动相，检测由透明质酸酶酶解后的透明质酸；以及基于检测结果计算透明质酸的含量，其中，高效液相色谱中使用的柱温为60℃～95℃。本发明专利技术的方法特别适合于检测含有柠檬酸的物质中的透明质酸的含量。

【技术实现步骤摘要】
一种测定包含有柠檬酸的溶液中的透明质酸含量的方法
本专利技术涉及透明质酸的检测领域，具体涉及一种测定透明质酸含量、特别是含柠檬酸的物质中的透明质酸含量的方法。
技术介绍
透明质酸(Hyaluronicacid，简称HA)又名玻璃酸或玻尿酸，是由(1-3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(1-4)-D-D-葡萄醛酸双糖重复单位所组成的高分子量的直链粘多糖。1934年由Meyer等人从牛玻璃球眼中首次提取获得。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，由于HA具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，同时无任何免疫原性和毒性，被广泛应用于化妆品、食品、医药和临床治疗等行业领域。大分子透明质酸可被细菌来源的透明质酸酶彻底水解为不饱和透明质酸双糖(ΔDiHA)，ΔDiHA在232nm处有特异性紫外吸收，可通过色谱柱与其它成分分离后用外标法检测其含量。目前，检测透明质酸常用的方法有HPLC法、比色法、CTAB比浊法和咔唑显色法。例如专利文献1公开了用咔唑显色法定量检测透明质酸发酵液中透明质酸含量的方法，但在检测前需要除去发酵液中的残留杂糖、色素等干扰因素。另外，在专利文献2中公开了一种交联透明质酸或其盐的交联度的测定方法，其中使用了分子筛色谱柱，流动相为0.1～1mol/L的KCl-磷酸盐缓冲液。在色谱法中，分离寡糖类物质一般选用采用氨基键合柱，此种色谱柱填料易水解，耐用性差，且流动相(水相)中需要添加像专利文献2那样的高浓度的缓冲盐才可将透明质酸双糖洗脱，长期使用高盐流动相会对液相管路系统造成损伤。因此，本专利技术人开发了一种不使用上述高浓度的缓冲盐，能够有效地检测透明质酸的方法。其中,使用了一类用于分析有机酸的离子交换柱，特别是MCIGELCK08EH色谱柱，能够将透明质酸双糖与其它小分子物质分离，柱效高，且耐用性好，流动相中不需要添加缓冲盐，由此建立了酶解法联合高效液相色谱法用于复杂配方保健食品中HA含量的检测的方法。现有技术文献专利文献专利文献1:CN108362686A专利文献2:CN107561179A
技术实现思路
然而上述本专利技术人开发的方法中，在检测含有柠檬酸的配方中的透明质酸(HA)含量时，由于柠檬酸和降解后的透明质酸钠即透明质酸钠二糖色谱的谱图或出峰时间非常近似，即，柠檬酸的保留时间与不饱和透明质酸双糖ΔDiHA保留时间相近，因此在含有柠檬酸的条件下，存在对透明质酸的检测的干扰问题。为了解决上述问题，本专利技术人对之前开发的方法、特别是其中的色谱条件进行了优化，从而确定了酶解法且联合使用用于分析有机酸的离子交换柱的高效液相色谱法测定透明质酸含量的方法中，能够将柠檬酸和ΔDiHA分离的色谱条件，从而成功地得到了适合用于在含柠檬酸的物质中检测透明质酸含量的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：1.一种测定透明质酸含量的方法，其包括利用透明质酸酶对包含透明质酸和柠檬酸的待测样品进行酶解；使用用于分析有机酸的离子交换柱，利用不含盐的流动相，检测由透明质酸酶酶解后的透明质酸；以及基于检测结果计算透明质酸的含量，其中，高效液相色谱中使用的柱温为60℃～95℃，特别是65℃。2.根据项1所述的方法，其中，所述用于分析有机酸的离子交换柱为阳离子交换色谱柱。3.根据项1或2所述的方法，其中，所述用于分析有机酸的离子交换柱为磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子H+型交换柱。4.根据项1～3中任一项所述的方法，其中，所述用于分析有机酸的离子交换柱为MCIGELCK08EH色谱柱或SilGreenGH0830078H色谱柱。5.根据项1～4中任一项所述的方法，其中，高效液相色谱的流动相为弱酸溶液，优选为磷酸溶液或乙酸溶液，进一步优选浓度为0.01wt％～0.2wt％的磷酸溶液或乙酸溶液。6.根据项1～5中任一项所述的方法，其中，流动相的流速为0.3～1.0ml/min，优选为0.4～0.6ml/min。7.根据项1～6中任一项所述的方法，其中，高效液相色谱的检测波长为205～235nm，例如为232nm。8.根据项1～7中任一项所述的方法，其中，高效液相色谱的进样量为10～100μL，优选为20～50μL。9.根据项1～8中任一项所述的方法，其用于含柠檬酸的物质中透明质酸含量的测定，柠檬酸的含量高于0.1‰。10.根据项9所述的方法，其中，所述含柠檬酸的物质为保健食品、药品、医疗器械、化妆品、毛发护理用品、口腔护理用品、纸制品。专利技术的效果本专利技术使用透明质酸酶对样品进行预处理，并结合液相色谱分离技术得到样品含量，方法特异性高。按照本专利技术的方法，能够防止用于糖的分析柱例如氨基柱的填料易水解、耐用性差，以及长期使用高盐流动相会对液相管路系统造成损伤的问题，能够更有效地检测透明质酸。而且该方法能够避免柠檬酸的存在对透明质酸的干扰，适合于含柠檬酸的物质、特别是含柠檬酸配方的保健食品中的透明质酸含量检测。附图说明图1为实施例1的液相色谱图。图2为参考例1的液相色谱图。图3为参考例2的液相色谱图。专利技术的具体实施方式本文中的术语“酶解法”，是利用活性酶来水解特定的某种物质，这种方法可用于一般的生物实验中，酶(enzyme)是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA。酶是一类极为重要的生物催化剂(biocatalyst)。由于酶的作用，生物体内的化学反应在极为温和的条件下也能高效和特异地进行。透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)是能使透明质酸产生低分子化作用酶的总称，本专利技术使用透明质酸酶可特异性裂解透明质酸钠双糖单位之间的糖苷键，终产物为带有一个双键的透明质酸钠二糖。在本专利技术中使用的透明质酸酶可以是任何现有技术中已知的能够裂解透明质酸钠双糖单位之间的糖苷键的酶，没有任何限制，可以购买市场上常用的用于降解透明质酸的酶来使用，但最优的酶为细菌来源的裂解酶，因为只有这样才可以将透明质酸彻底降解为带双键的二糖单位。市面上能买到的酶基本都是动物睾丸提取的透明质酸酶，最终降解产物是四糖和六糖的混合物，而且不易达到彻底降解效果。色谱法(chromatography)又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。HPLC的固定相有以下几种：(1)硅胶表面键合或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定透明质酸含量的方法，其包括：利用透明质酸酶对包含透明质酸和柠檬酸的待测样品进行酶解；使用用于分析有机酸的离子交换柱，利用不含盐的流动相，检测由透明质酸酶酶解后的透明质酸；以及基于检测结果计算透明质酸的含量，其中，高效液相色谱中使用的色谱柱的柱温保持在60℃～95℃的范围。

【技术特征摘要】
1.一种测定透明质酸含量的方法，其包括：利用透明质酸酶对包含透明质酸和柠檬酸的待测样品进行酶解；使用用于分析有机酸的离子交换柱，利用不含盐的流动相，检测由透明质酸酶酶解后的透明质酸；以及基于检测结果计算透明质酸的含量，其中，高效液相色谱中使用的色谱柱的柱温保持在60℃～95℃的范围。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述离子交换柱为阳离子交换色谱柱。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述离子交换柱为磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子H+型交换柱。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述用于分析有机酸的离子交换柱为MCIGELCK08EH色谱柱或SilGreenGH0830078H色谱柱。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，高效液相色谱的流动相为弱...

【专利技术属性】
技术研发人员：李芸，陈玉娟，刘建建，陈雯雯，刘英，王罡，万金玉，栾贻宏，郭学平，
申请(专利权)人：华熙福瑞达生物医药有限公司，山东华熙海御生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37