一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法，属于水产动物病毒的分子检测技术领域，所述引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，用于检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒。以该引物对河蟹待测样本进行检测，若RPA扩增产物含有大小为160bp的片段，则所述待测河蟹中含有了布尼亚病毒。该RPA引物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明专利技术提供了一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的方法，具有操作简单，稳定性好，为有效检测和鉴定河蟹布尼亚病毒提供一种成本低、快速、特异性强的现场诊断方法。

A primer and detection method based on RPA technology for detecting river crab Bunia virus

The invention discloses a primer and a detection method for detecting river crab Bunia virus based on RPA technology, belonging to the field of molecular detection technology of aquatic animal virus. The primer, as shown in SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO.2, is used for detecting or assisting detection of river crab Bunia virus. The primer was used to detect the samples of river crab. If the amplified product of RPA contained a 160bp fragment, the river crab contained Bunia virus. The RPA primer has strong specificity, high sensitivity and accurate detection results. The invention provides a method for detecting river crab Bunia virus based on RPA technology, which has the advantages of simple operation and good stability, and provides a low cost, fast and specific field diagnosis method for effectively detecting and identifying river crab Bunia virus.

【技术实现步骤摘要】
一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法
本专利技术属于水产动物病毒的分子检测
，涉及到一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法。
技术介绍
河蟹学名中华绒螯蟹，又名大闸蟹，隶属于节肢动物门、甲壳纲、绒螯蟹属，河蟹适应性强，分布较广，主要分布于我国沿海诸省各大水系，由此形成长江水系、辽河水系、瓯江水系和闽江水系4个种群。河蟹是洄游性甲壳类动物，经济价值较高，河蟹肉质细嫩，蟹黄蟹膏不仅口感鲜美而且营养丰富，历来被人们视为水产珍宝，是世界各国水产增养殖的重要对象。近年来河蟹市场需求量日益增加，其养殖规模不断扩大，养殖环境也越来越恶劣，病害发生越来越多。河蟹已知的病毒包括：呼肠孤病毒(EsRV816，905及2012)、布尼亚病毒(EsBV)、及白斑综合症病毒(WSSV)等几类。这些病毒都具有垂直传播的特性。这些病毒在一定条件下可以使河蟹致病，甚至致死。为河蟹养殖经济带来巨大的损伤。其中，河蟹布尼亚病毒(Buniavirus)是一类具球形、有包膜和分节段负链RNA病毒，表面有糖蛋白突起，能自然感染于河蟹等节肢动物，从而引起河蟹传染病。河蟹布尼亚病毒是河蟹颤抖病的病原之一。该病毒造成河蟹活动力下降，饮食减少，严重者可导致河蟹死亡。目前，针对该病毒尚无有效的治疗方法，病毒的早期准确检测对疾病的预防和控制尤为重要，因此建立一种简便、快速、灵敏、准确的病毒检测方法对病毒病的防控具有重要意义。目前应用较多病毒检测方法有聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR和荧光定量PCR等技术。但这些方法均需要昂贵的PCR仪或特殊仪器设备和专业的试验场地，同时PCR扩增的过程，操作复杂繁琐、耗时长，时效性低，并且需要具有一定分子生物学基础及操作技术的专业人员才能完成，不能满足水产养殖现场检测诊断的需求。重组酶介导等温扩增(RecombinasePolymeraseAmlification，RPA)技术被公认是可以替代PCR的核酸检测技术。其原理是利用重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。另外，RPA技术有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远高于传统的PCR技术，所用时间更短，最短可在5min内实现。由于RPA技术具有扩增用时短、不需昂贵仪器、特异性好等特点，使其应用越来越广泛。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法技术方案本专利技术第一个目的是提供一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物，所述引物包括上游引物RPAESBV-1F和下游引物RPAESBV-1R，所述上游引物RPAESBV-1F的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述下游引物RPAESBV-1R的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术第二个目的是提供上述引物在检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒中的应用。本专利技术第三个目的是提供一种利用基于RPA试剂盒技术检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒的RPA试剂盒，所述RPA试剂盒包括权利要求1所述的引物。本专利技术第四个目的是提供一种利用基于RPA试剂盒技术检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒的方法，具体包括以下步骤：(1)cDNA制备：从待测河蟹肝胰脏或待测病原菌其他河蟹组织中提取病毒RNA，然后反转录成cDNA备用；(2)RPA扩增及琼脂糖凝胶电泳：以步骤(1)中制备的cDNA作为模板，以权利要求3或4所述用权利要求3所述的RPA试剂盒内的试剂进行RPA扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测RPA扩增产物大小；(3)结果判定：若所述RPA扩增产物含有大小为160bp的片段，则所述待测河蟹中含有了布尼亚病毒，若所述RPA扩增产物不含有大小为160bp的片段，则所述待测河蟹中不含有布尼亚病毒。所述步骤(2)RPA扩增及琼脂糖凝胶电泳的具体步骤如下所示：(1)配制47.5μl的混合反应液，包括29.5μlRehydrationBuffer,10μM的上游引物2.4μl，10μM的下游引物2.4μl，模板cDNA1μl和dH2O12.5μl；(2)混合液混匀后转移至含有冻干酶粉的反应单元管中，用移液枪混匀，使管中颗粒全部悬浮，加入280mM醋酸镁溶液2.5μl，盖上管盖，快速混匀，在39℃金属浴反应4min，4min结束后，取出，剧烈翻转8-10次，混匀，重新放入金属浴上反应40min；RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1∶1)溶液，充分混匀后，11,000×g离心3min，取上清液10μL于1.0％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳检测电压180V，电流250A，检测时间20min，在凝胶成像系统上观察结果。与现有技术相比，本专利技术具有以下的优点：1、本专利技术所设计的RPA检测专用引物对长度在30-35bp，比一般的PCR检测引物长。引物过短会降低重组率，影响RPA反应的扩增速度和检测灵敏度。2、本专利技术提供了一组使用于河蟹布尼亚病毒RPA检测的引物对，将该引物对应用于河蟹布尼亚病毒的RPA检测中，具有简单便捷，快速检测，特异性强，灵敏度高等优点。3、本专利技术检测方法无需对病毒进行分离纯化及培养，反应在39℃左右的恒温条件下即可实现模板核酸的扩增，也不需要通过高低温循坏实现核酸解链和退火，因此不需要昂贵的仪器设备，非常适合基层对病原菌的快速检测需要。4、本专利技术用于河蟹组织中布尼亚病毒的快速检测，RPA检测时间仅需40min，从病毒提取到获得检测结果的所有过程只需约2.5h即可完成，是一种用于检测河蟹感染布尼亚病毒的有效手段。5、本专利技术检测方法用于河蟹发病前期检测及病害预测预防，对于确定防治期、有效防治病害具有非常重要的意义。附图说明图1是RPA引物扩增凝胶电泳图。其中，泳道M为Marker500，1为引物RPAESBV-1R-1F，2为RPAESBV-2R-2F，3为阴性对照，4为控制对照。图2是不同RPA反应温度下的凝胶电泳图。其中，泳道为Marker500、1为37℃、2为39℃、3为40℃、4为41℃、5为42℃。图3是不同RPA反应时间下的凝胶电泳图。其中，泳道M为Marker500、1为10min、2为20min、3为30min、4为40min、5为50min。图4是RPA与PCR反应灵敏度检测凝胶电泳图。其中，A为RPA反应、B为PCR反应；泳道为Marker500、1为1400pg/μL、2为100pg/μL、3为10pg/μL、4为1pg/μL、5为100fg/μL。图5是RPA检测特异性凝胶电泳图。其中，M为Marker500、1为河蟹布尼亚病毒(ESBV)、2为河蟹呼肠孤病毒(ESRV)、3为河蟹呼肠孤-816病毒(ESRV-816)、4为河蟹呼肠孤-905病毒(ESRV-905)、5为河蟹诺达病毒(ESNV)、6为对虾白斑病毒(WWSV)、7为阴性对照。具体实施方式下列实施例仅为本专利技术的优选技术方案，并不用于对本专利技术进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本专利技术可以有各种更改和变化。凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。若未特别指明，以下实施例均照常规本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物，其特征在于：所述引物包括上游引物RPA ESBV‑1F和下游引物RPA ESBV‑1R，所述上游引物RPA ESBV‑1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物RPA ESBV‑1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物，其特征在于：所述引物包括上游引物RPAESBV-1F和下游引物RPAESBV-1R，所述上游引物RPAESBV-1F的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述下游引物RPAESBV-1R的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种根据权利要求1所述引物在检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒中的应用。3.一种基于RPA技术检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒的RPA试剂盒，其特征在于：所述RPA试剂盒包括权利要求1所述的引物。4.一种基于RPA技术检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒的方法，具体包括以下步骤：(1)cDNA制备：从待测河蟹肝胰脏或其他河蟹组织中提取病毒RNA，然后反转录成cDNA备用；(2)RPA扩增及琼脂糖凝胶电泳：以步骤(1)中制备的cDNA作为模板，用权利要求3所述的RPA试剂盒进行RPA扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测RPA扩增产物大小；(3)结果判定：若所述RPA扩增产物含有大小为160bp的片段，则所述待测河蟹中含有了布尼亚病毒，若所述RPA扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈怀舜，臧亚南，胡亚成，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32