The invention relates to an optimization method of a digital PCR detection system for EGFR gene T790M mutation, which includes upstream primers, downstream primers, wild-type probes, mutant probes, wild-type templates and mutant templates; wild-type templates are normal human gDNA after enzymatic digestion, and mutant templates are mutant plasmids inserted into the mutant fragment of EGFR gene T790M after enzymatic digestion; The standard products were prepared with wild-type template according to a certain proportion of copies. The fluorescent regions of wild-type and mutant were selected by using digital PCR to react with medium mutation frequency standard products as templates and making statistical data maps based on reaction data. The background thresholds were determined by using the wild-type template as the template for digital PCR. The optimized method of the EGFR gene T790M mutation digital PCR detection system has higher detection accuracy.
【技术实现步骤摘要】
EGFR基因T790M突变数字PCR检测体系的优化方法及检测产品
本专利技术涉及检测人类EGFR基因T790M突变的数字PCR检测产品及其优化方法,属于生物
技术介绍
在世界范围内,肺癌是发病率和死亡率位居首位的恶性肿瘤。在肺癌患者中,非小细胞肺癌(NSCLC)的发生率为85%,其中超过7成处于中晚期。其中,表皮生长因子受体基因(EGFR)是我国肺腺癌发生的主要驱动基因。表皮生长因子受体(EGFR)属于络氨酸激酶型受体,贯穿细胞膜,其胞内部分为其激酶活性区域。激活后的EGFR单体转化为激活状态的二聚体,可引导下游的磷酸化,诱导细胞的增值。EGFR基因络氨酸激酶活性区域包含一系列的激活突变,其中常见的有包括19号外显子中碱基的确实和21号外显子中的点突变(L858R)。EGFR络氨酸激酶抑制剂(如:厄洛替尼和吉非替尼)对携带络氨酸激酶区域至活突变的患者具有较灵敏的效果。但是,具有络氨酸激酶抑制剂(TKI)敏感突变的患者,会在2年内产生药物抗性。抗性的产生60%是由于EGFR基因T790M突变引起的。针对EGFR-TKIs耐药性,已经产生多种新一代的药物,这些药物可抑制具有T790M突变的激酶活性。因此,为达到准确用药的目的,对EGFR基因的T790M突变的检测成为必要。传统检测T790M突变的方法采用的组织活检,这种方法存在取材难,具侵入创伤问题。此外,传统的组织活检存在肿瘤组织异质性的局限。循环肿瘤DNA(ctDNA)是指来自于肿瘤组织释放进入血浆的DNA,携带有来自肿瘤组织的实时信息。因此,对ctDNA进行检测,不仅可以做到无创伤,并且可以做到 ...
【技术保护点】
1.一种EGFR基因T790M突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板;所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA,所述突变型模板是酶切后的插入EGFR基因T790M突变片段的突变质粒;将突变型模板和野生型模板按1:50至1:200的拷贝数比例配制成中突变频率标准品,采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应,根据反应数据制作数据统计图,选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域,突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同;采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应,突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。
【技术特征摘要】
1.一种EGFR基因T790M突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板;所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示,所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示,所述野生型探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示,所述突变型探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示;所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA,所述突变型模板是酶切后的插入EGFR基因T790M突变片段的突变质粒;将突变型模板和野生型模板按1:50至1:200的拷贝数比例配制成中突变频率标准品,采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应,根据反应数据制作数据统计图,选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域,突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同;采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应,突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。2.根据权利要求1所述的EGFR基因T790M突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:将突变型模板和野生型模板按1:1至1:10的拷贝数比例配制成高突变频率标准品,采用实时荧光定量PCR以低突变频率标准品为模板进行反应,根据反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系,优化野生型探针和突变型探针的使用浓度。3.根据权利要求2所述的EGFR基因T790M突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:所述反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系是反应终点荧光值与初始荧光值的比值越大,且反...
【专利技术属性】
技术研发人员:赵新泰,王明,潘文健,
申请(专利权)人:上海赛安生物医药科技股份有限公司,
类型:发明
国别省市:上海,31
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