PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法及检测产品技术

技术编号:20264524 阅读:90 留言:0更新日期:2019-02-02 01:04
本发明专利技术涉及一种PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法,检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板;野生型模板是酶切后的正常人体gDNA,突变型模板是酶切后的插入PIK3CA基因H1047R突变片段的突变质粒;将突变型模板和野生型模板按一定的拷贝数比例配制成标准品,采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应,根据反应数据制作数据统计图,选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域。采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应,确定背景阈值。通过本发明专利技术的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法优化后的检测产品准确度更高。

Optimizing the Detection System of PIK3CA Gene H1047R Mutation by Digital Polymerase Chain Reaction and Detecting Products

The invention relates to an optimization method of a digital PCR detection system for PIK3CA gene H1047R mutation, which includes upstream primers, downstream primers, wild-type probes, mutant probes, wild-type templates and mutant templates; wild-type templates are normal human gDNA after enzymatic digestion, and mutant templates are mutant plasmids inserted into the mutant fragment of PIK3CA gene H1047R after enzymatic digestion; The template and wild-type template were prepared according to a certain proportion of copies. The fluorescence regions of wild-type and mutant were selected by using digital PCR to react with the medium mutation frequency standard as the template, and making the data statistical map according to the reaction data. The background thresholds were determined by using the wild-type template as the template for digital PCR. The optimized method of the PIK3CA gene H1047R mutation digital PCR detection system has higher detection accuracy.

【技术实现步骤摘要】
PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法及检测产品
本专利技术涉及检测人类PIK3CA基因H1047R突变的数字PCR检测产品及其优化方法,属于生物

技术介绍
磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α(PIK3CA)基因首次利用原位杂交技术,被鉴定为是染色体3q26.3上一段长度为34kb的基因。PIK3CA由20个外显子组成,编码I类磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的p110α催化亚基。PI3K是一类磷酸化肌醇脂3位羟基激酶,称为PI3Ks家族。I类PI3Ks是由一个p110催化亚单位和一个p85调节亚单位组成的异二聚体,由生长因之受体和胰岛素受体等激活,PI3Ks通常表达在胞质,产生拥有第二信使作用的肌醇类物质,在细胞的形态、活力、侵袭性、凋亡及细胞周期调控中起着重要的作用。PI3K-Akt(磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B)信号通路是调节细胞功能的重要信号途径,当PIK3CA基因以基因扩增或点突变的形式被激活是,其转录与翻译将升高,通过PI3K/AKT途径是AKT过度激活,无节制的促进细胞的生长和繁殖,同时会抑制细胞的凋亡,最终将导致肿瘤的发生。PIK3CA基因是一种原癌基因,其突变形式包括扩增、缺失和体细胞错义突变等。PIK3CA基因可在多种人类肿瘤中存在突变,导致PI3K信号途径在不同水平发生调控异常,其在结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤中发生高频体细胞突变。有研究指出PIK3CA基因突变,是除HER2基因扩增、p53基因突变之外乳腺癌常见基因突变之一,突变近80%发生在螺旋区和激酶区,分别对应PIK3CA基因的第9号外显子(E542K、E545D、E545K突变位点)和第20号外显子(H1047R、H1047L)。携带有PIK3CA基因突变的患者对EGFR、HER2靶向药物治疗存在耐药性。例如,PIK3CA基因突变的乳癌患者对ErbB1/ErbB2双重酪氨酸激酶受体抑制剂拉帕替尼(TYKERB,商品名Tykerb)在内的常规HER2靶向治疗耐药。PIK3CA基因突变乳腺癌患者对Her2靶向药物注射用曲妥珠单抗耐药,PIK3CA基因突变结直肠癌患者对以EGFR为靶点的单克隆抗体西妥昔单抗产生耐药。因此,在癌症治疗过程中,对癌症患者进行PIK3CA基因的特定突变进行检测,是做到精准用药的关键,也可防止药物勿用带来的经济损失与治疗时间延误。传统的针对对基因特定位点的突变检测常用的方法有一代测序和qPCR,但其灵敏度较低,因此需要具备高突变比例的组织标本进行检测,不适合实时检测监控。血浆游离DNA(cfDNA)是存在于血浆中的一种小片段DNA,平均长度在180bp,由体细胞产生释放进入血液。ctDNA是由肿瘤细胞释放进入血液的片段化DNA,因此,可通过检测ctDNA中的突变信息反应肿瘤细胞的突变信息。对cfDNA中的ctDNA的检测成为检测肿瘤突变的一种途径。cfDNA用于肿瘤突变检测优势在于操作无创,可实现实时检测和动态监测,克服肿瘤组织的异质性。然而,ctDNA所占cfDNA的含量极低,低于百分之一,传统检测方法无灵敏且准确的检测出血浆游离DNA中所包含突变信息。数字PCR(dPCR)的出现革新了传统PCR检测的发展,极大的提高了检测的灵敏度。通过统计大量的单拷贝反应微滴,大大的提高了准确度和精密度。由于dPCR统计的是单个分子总数,理论上能做到每个反应单位为单拷贝模板。因此,数字PCR可以达到绝对定量。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可以使得数字PCR反应体系检测的准确度有更高的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法,以及通过该优化方法优化后的检测产品。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:一种PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法,所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板;所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示,所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示,所述野生型探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示,所述突变型探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示;所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA,所述突变型模板是酶切后的插入PIK3CA基因H1047R突变片段的突变质粒;将突变型模板和野生型模板按1:50至1:200的拷贝数比例配制成中突变频率标准品,采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应,根据反应数据制作数据统计图,选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域,突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同;采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应,突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。将突变型模板和野生型模板按1:1至1:10的拷贝数比例配制成高突变频率标准品,采用实时荧光定量PCR以低突变频率标准品为模板进行反应,根据反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系,优化野生型探针和突变型探针的使用浓度。所述反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系是反应终点荧光值与初始荧光值的比值越大,且反应终点荧光值与初始荧光值的差值越大,则野生型探针和突变型探针的使用浓度越好。将突变型模板和野生型模板按1:1000至1:10000的拷贝数比例配制成低突变频率标准品,采用数字PCR以低突变频率标准品为模板进行反应,若突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数大于所述背景阈值的2.5倍,则该检测体系的灵敏度达到低突变频率标准品的拷贝数比例相同的值。所述野生型探针和突变型探针是MGB探针,所述野生型探针和突变型探针的3’端均为NFQ基团。所述野生型探针的5’端为VIC基团,所述突变型探针的5’端为FAM基团。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:采用上述的优化方法优化后的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测产品。所述上游引物和下游引物在反应体系中的终浓度为900nM,所述野生型探针在反应体系中的终浓度为100nM,突变型探针在反应体系中的终浓度为200nM。所述野生型探针和突变型探针是MGB探针,所述野生型探针和突变型探针的3’端均为NFQ基团;所述野生型探针的5’端为VIC基团,所述突变型探针的5’端为FAM基团。本专利技术具有积极的效果:(1)本专利技术的PIK3CA基因H1047R突变检测体系,采用的标准品是用酶切后的正常人体gDNA和酶切后的插入PIK3CA基因H1047R突变片段的突变质粒按拷贝数比例配制而成,不同突变频率标准品起到不同的作用。标准品采用gDNA和质粒可以最大程度的还原检测样本的特征,给体系的优化提供了很多的基础,在体系优化中起到决定性的作用。(2)本专利技术的PIK3CA基因H1047R突变检测体系通过中突变频率标准品的数字PCR检测结果确定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域,使得数据统计的结果更加准确。本专利技术的PIK3CA基因H1047R突变检测体系通过野生型模板的数字PCR检测结果确定检测体系的背景阈值,检测样本的突变拷贝数时,突变拷贝数等于检测结果减去背景阈值,可以使得结果更加准确。本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板;所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA,所述突变型模板是酶切后的插入PIK3CA基因H1047R突变片段的突变质粒;将突变型模板和野生型模板按1:50至1:200的拷贝数比例配制成中突变频率标准品,采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应,根据反应数据制作数据统计图,选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域,突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同;采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应,突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。

【技术特征摘要】
1.一种PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板;所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示,所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示,所述野生型探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示,所述突变型探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示;所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA,所述突变型模板是酶切后的插入PIK3CA基因H1047R突变片段的突变质粒;将突变型模板和野生型模板按1:50至1:200的拷贝数比例配制成中突变频率标准品,采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应,根据反应数据制作数据统计图,选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域,突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同;采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应,突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。2.根据权利要求1所述的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:将突变型模板和野生型模板按1:1至1:10的拷贝数比例配制成高突变频率标准品,采用实时荧光定量PCR以低突变频率标准品为模板进行反应,根据反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系,优化野生型探针和突变型探针的使用浓度。3.根据权利要求2所述的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:所述反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系是反应终点荧光值与初始荧光值的比值越大,且反应终点荧光值与初始荧光值的...

【专利技术属性】
技术研发人员:赵新泰王明潘文健
申请(专利权)人:上海赛安生物医药科技股份有限公司
类型:发明
国别省市:上海,31

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