The invention relates to an optimization method of a digital PCR detection system for PIK3CA gene H1047R mutation, which includes upstream primers, downstream primers, wild-type probes, mutant probes, wild-type templates and mutant templates; wild-type templates are normal human gDNA after enzymatic digestion, and mutant templates are mutant plasmids inserted into the mutant fragment of PIK3CA gene H1047R after enzymatic digestion; The template and wild-type template were prepared according to a certain proportion of copies. The fluorescence regions of wild-type and mutant were selected by using digital PCR to react with the medium mutation frequency standard as the template, and making the data statistical map according to the reaction data. The background thresholds were determined by using the wild-type template as the template for digital PCR. The optimized method of the PIK3CA gene H1047R mutation digital PCR detection system has higher detection accuracy.
【技术实现步骤摘要】
PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法及检测产品
本专利技术涉及检测人类PIK3CA基因H1047R突变的数字PCR检测产品及其优化方法,属于生物
技术介绍
磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α(PIK3CA)基因首次利用原位杂交技术,被鉴定为是染色体3q26.3上一段长度为34kb的基因。PIK3CA由20个外显子组成,编码I类磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的p110α催化亚基。PI3K是一类磷酸化肌醇脂3位羟基激酶,称为PI3Ks家族。I类PI3Ks是由一个p110催化亚单位和一个p85调节亚单位组成的异二聚体,由生长因之受体和胰岛素受体等激活,PI3Ks通常表达在胞质,产生拥有第二信使作用的肌醇类物质,在细胞的形态、活力、侵袭性、凋亡及细胞周期调控中起着重要的作用。PI3K-Akt(磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B)信号通路是调节细胞功能的重要信号途径,当PIK3CA基因以基因扩增或点突变的形式被激活是,其转录与翻译将升高,通过PI3K/AKT途径是AKT过度激活,无节制的促进细胞的生长和繁殖,同时会抑制细胞的凋亡,最终将导致肿瘤的发生。PIK3CA基因是一种原癌基因,其突变形式包括扩增、缺失和体细胞错义突变等。PIK3CA基因可在多种人类肿瘤中存在突变,导致PI3K信号途径在不同水平发生调控异常,其在结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤中发生高频体细胞突变。有研究指出PIK3CA基因突变,是除HER2基因扩增、p53基因突变之外乳腺癌常见基因突变之一,突变近80%发生在螺旋区和激酶区,分别对 ...
【技术保护点】
1.一种PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板;所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA,所述突变型模板是酶切后的插入PIK3CA基因H1047R突变片段的突变质粒;将突变型模板和野生型模板按1:50至1:200的拷贝数比例配制成中突变频率标准品,采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应,根据反应数据制作数据统计图,选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域,突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同;采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应,突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。
【技术特征摘要】
1.一种PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板;所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示,所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示,所述野生型探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示,所述突变型探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示;所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA,所述突变型模板是酶切后的插入PIK3CA基因H1047R突变片段的突变质粒;将突变型模板和野生型模板按1:50至1:200的拷贝数比例配制成中突变频率标准品,采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应,根据反应数据制作数据统计图,选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域,突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同;采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应,突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。2.根据权利要求1所述的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:将突变型模板和野生型模板按1:1至1:10的拷贝数比例配制成高突变频率标准品,采用实时荧光定量PCR以低突变频率标准品为模板进行反应,根据反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系,优化野生型探针和突变型探针的使用浓度。3.根据权利要求2所述的PIK3CA基因H1047R突变数字PCR检测体系的优化方法,其特征在于:所述反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系是反应终点荧光值与初始荧光值的比值越大,且反应终点荧光值与初始荧光值的...
【专利技术属性】
技术研发人员:赵新泰,王明,潘文健,
申请(专利权)人:上海赛安生物医药科技股份有限公司,
类型:发明
国别省市:上海,31
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