EGFR基因E19del突变数字PCR检测体系的优化方法及检测产品技术

本发明专利技术涉及一种EGFR基因E19del突变数字PCR检测体系的优化方法，检测体系包括上游引物、下游引物、探针A、探针B、野生型模板和突变型模板；野生型模板是酶切后的正常人体gDNA，突变型模板是酶切后的插入EGFR基因E19del突变片段的突变质粒；将突变型模板和野生型模板按一定的拷贝数比例配制成标准品，采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应，根据反应数据制作数据统计图，选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域。采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应，确定背景阈值。通过本发明专利技术的EGFR基因E19del突变数字PCR检测体系的优化方法优化后的检测产品准确度更高。

Optimization of Detection System for E19del Mutation of EGFR Gene by Digital Polymerase Chain Reaction and Detection Products

The present invention relates to an optimization method of digital PCR detection system for E19del mutation of EGFR gene, which includes upstream primers, downstream primers, probe A, probe B, wild-type template and mutant template; wild-type template is gDNA of normal human body after enzymatic digestion; mutant template is mutant plasmid inserted into E19del mutation fragment of EGFR gene after enzymatic digestion; mutant template and wild-type template are used to detect mutation. The template was prepared according to a certain proportion of copies. Digital PCR was used to react with the standard of medium mutation frequency. Data statistics were made according to the reaction data. The fluorescence regions of wild type and mutant type were selected. The background thresholds were determined by using the wild-type template as the template for digital PCR. The optimized method of the EGFR gene E19del mutation digital PCR detection system has higher detection accuracy.

【技术实现步骤摘要】
EGFR基因E19del突变数字PCR检测体系的优化方法及检测产品
本专利技术涉及检测人类EGFR基因E19del突变的数字PCR检测产品及其优化方法，，属于生物

技术介绍
在世界范围内，肺癌是肿瘤性死亡首因，严重危害着人类的健康。全球每年约有150万的人死于肺癌。空气污染的污染，吸烟的影响等都进一步加剧了肺癌的发生。肺癌的发病率和死亡率居所有恶性肿瘤的首位。因此，肺癌的早期诊断及治疗一直是研究的终点，也是防治肺癌的关键。EGFR(表皮生长因子受体)基因是非小细胞肺癌(NSCLC)和部分肺腺癌的驱动基因。具有EGFR基因激活突变的肿瘤细胞对EGFR络氨酸激酶抑制剂(TKIs)敏感，这类EGFR络氨酸激酶抑制剂诸如常见的吉非替尼和厄洛替尼等。EGFR基因最常见的突变发生在发挥激酶催化活性的编码区，常见的突变包括19号外显子区域确实导致的编码框的移动和21号外显子上发生的亮氨酸替代精氨酸(L858R)的突变。一般具有这类突变的肿瘤患者2年内可保持对TKIs敏感。然而，几乎百分之六十的患者会产生T790M突变而获得对第一代TKIs抗性。为克服一代肿瘤抑制剂抗性，开发了新一代的药物针对具有T790M突变的EGFR蛋白活性。与此同时，EGFR基因的其他突变也会引起EGFR蛋白的持续激活，诱发肿瘤和产生抗性。因此，对传统的EGFR抑制剂和新一代EGFR抑制剂药物的选择需要基于对EGFR突变的检测基础上。传统的检测EGFR基因L858R点突变常用的标本为病理组织或细胞学标本，但是组织取材具有创伤性特点。受到肿瘤大小和部位的影响，时常难以取得满意的组织或无法取样。与此同时，随着疾病的进展，需连续进行取样，而组织取样为有创操作无法进行便捷、反复进行。循环肿瘤DNA(ctDNA)，是由肿瘤组织和循环肿瘤细胞释放到血液中的DNA。因此，对ctDNA进行检测可获取肿瘤组织的EGFR突变信息。由于ctDNA含量低，相对于全部cfDNA，ctDNA所占的比例极低。因此，通过一代测序和qPCR检测方法，无法灵敏的获取其中所包含的肿瘤体细胞的突变信息。数字PCR(dPCR)的出现促进了传统PCR检测的发展，其检测灵敏度可达到万分之一，极大的提高了检测的灵敏度。通过统计大量的单拷贝反应微滴，大大的提高了准确度和精密度。因此，dPCR检测技术可完美的解决血浆中，ctDNA含量低的问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可以使得数字PCR反应体系检测的准确度有更高的EGFR基因E19del突变数字PCR检测体系的优化方法，以及通过该优化方法优化后的检测产品。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种EGFR基因E19del突变数字PCR检测体系的优化方法，所述检测体系包括上游引物、下游引物、探针A、探针B、野生型模板和突变型模板；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述探针A的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述探针B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA，所述突变型模板是酶切后的插入EGFR基因E19del突变片段的突变质粒；将突变型模板和野生型模板按1:100至1:900的拷贝数比例配制成中突变频率标准品，采用中突变频率标准品为模板进行反应，根据反应数据制作数据统计图，选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域，突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与标准品理论的突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同；采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应，突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。将突变型模板和野生型模板按1:1至1:10的拷贝数比例配制成高突变频率标准品，采用实时荧光定量PCR以低突变频率标准品为模板进行反应，根据反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系，优化探针A和探针B的使用浓度。所述反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系是反应终点荧光值与初始荧光值的比值越大，且反应终点荧光值与初始荧光值的差值越大，则探针A和探针B的使用浓度越好。将突变型模板和野生型模板按1:1000至1:10000的拷贝数比例配制成低突变频率标准品，采用数字PCR以低突变频率标准品为模板进行反应，若突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数大于所述背景阈值的2.5倍，则该检测体系的灵敏度达到低突变频率标准品的拷贝数比例相同的值。所述探针A和探针B是MGB探针，所述探针A和探针B的3’端均为NFQ基团。所述探针B的5’端为VIC基团，所述探针A的5’端为FAM基团。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：采用上述的优化方法优化后的EGFR基因E19del突变数字PCR检测产品。所述上游引物和下游引物在反应体系中的终浓度为900nM，所述探针A和探针B在反应体系中的终浓度为200nM。所述探针A和探针B是MGB探针，所述探针A和探针B的3’端均为NFQ基团；所述探针A的5’端为FAM基团，所述探针B的5’端为VIC基团。本专利技术具有积极的效果：(1)本专利技术的EGFR基因E19del突变检测体系，采用的标准品是用酶切后的正常人体gDNA和酶切后的插入EGFR基因E19del突变片段的突变质粒按拷贝数比例配制而成，不同突变频率标准品起到不同的作用。标准品采用gDNA和质粒可以最大程度的还原检测样本的特征，给体系的优化提供了很多的基础，在体系优化中起到决定性的作用。(2)本专利技术的EGFR基因E19del突变检测体系通过中等突变频率标准品的数字PCR检测结果确定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域，使得数据统计的结果更加准确。本专利技术的EGFR基因E19del突变检测体系通过野生型模板的数字PCR检测结果确定检测体系的背景阈值，检测样本的突变拷贝数时，突变拷贝数等于检测结果减去背景阈值，可以使得结果更加准确。(3)本专利技术的EGFR基因E19del突变检测体系通过低突变频率标准品的数字PCR检测结果，可以确定检测体系的灵敏度。(4)本专利技术的EGFR基因E19del突变检测体系通过高突变频率标准品的传统实时荧光PCR检测结果进行探针浓度优化，根据反应前荧光强度(F0)与反应后荧光强度(Fn)差值和比值较大的反应体系为标准，选择合适的探针浓度，该方法结果准确，成本较低。(5)本专利技术的EGFR基因E19del突变检测体系的引物探针为自行设计，探针为MGB探针，探针序列更短，特异性好。引物探针经过多重组合优化选定，扩增效率高，灵敏度高。(6)本专利技术的EGFR基因E19del突变检测体系中的探针采用双探针识别体系，将带有FAM荧光基团的荧光基团的探针A设计在E19del缺失区域上，将带有VIC荧光基团的探针B设计在E19del序列区域的附近，经过dPCR反应，产生FAM和VIC的双色荧光即为野生型模板，产生单VIC荧光的即为突变型模板。这样探针设计使得体系更为稳定，降低了背景荧光信号的影响，准确度更高。这样探针设计对E19del的多种突变形式均具有识别作用，检测体系的兼容性好，更高效。(7)本专利技术的优化后的EGFR基因E19del突变检测体系快速，高效，成本较低，准确度高可根据血浆中微量的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种EGFR基因E19del突变数字PCR检测体系的优化方法，其特征在于：所述检测体系包括上游引物、下游引物、探针A、探针B、野生型模板和突变型模板；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述探针A的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探针B的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA，所述突变型模板是酶切后的插入EGFR基因E19del突变片段的突变质粒；将突变型模板和野生型模板按1:100至1:900的拷贝数比例配制成中突变频率标准品，采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应，根据反应数据制作数据统计图，选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域，突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与标准品理论的突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同；采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应，突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。

【技术特征摘要】
1.一种EGFR基因E19del突变数字PCR检测体系的优化方法，其特征在于：所述检测体系包括上游引物、下游引物、探针A、探针B、野生型模板和突变型模板；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述探针A的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述探针B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA，所述突变型模板是酶切后的插入EGFR基因E19del突变片段的突变质粒；将突变型模板和野生型模板按1:100至1:900的拷贝数比例配制成中突变频率标准品，采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应，根据反应数据制作数据统计图，选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域，突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与标准品理论的突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同；采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应，突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。2.根据权利要求1所述的EGFR基因E19del突变数字PCR检测体系的优化方法，其特征在于：将突变型模板和野生型模板按1:1至1:10的拷贝数比例配制成高突变频率标准品，采用实时荧光定量PCR以低突变频率标准品为模板进行反应，根据反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系，优化探针A和探针B的使用浓度。3.根据权利要求2所述的EGFR基因E19del突变数字PCR检测体系的优化方法，其特征在于：所述反应终点荧光值和初始荧光值与探针使用浓度的关系是反应终点荧光值与初始荧光值...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵新泰，王明，潘文健，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31