一种天然α-syn寡聚体抗体的制备方法及其产品和应用技术

技术编号:20261577 阅读:28 留言:0更新日期:2019-02-02 00:01
本发明专利技术涉及一种天然α‑syn寡聚体抗体的制备方法及其产品和应用,所述制备方法为利用聚丙烯酰胺凝胶和交联的α‑syn寡聚体制备α‑syn寡聚体亲和凝胶,将静脉注射免疫球蛋白稀释后上样于α‑syn寡聚体亲和凝胶柱,然后用洗脱液将结合的抗体洗脱出来,得到天然α‑syn寡聚体抗体。该法制备得到的天然α‑syn寡聚体抗体靶向性明确、专一,使用剂量易控制,从而能充分发挥该类抗体的治疗作用,在帕金森病等α‑syn相关的疾病治疗方面具有广泛的应用前景。

Preparation and application of a natural alpha-syn oligomer antibody

The invention relates to a preparation method of natural alpha syn oligomeric antibody and its products and applications. The preparation method is to prepare alpha syn oligomer affinity gel by using polyacrylamide gel and cross-linked alpha syn oligomer, dilute the intravenous immunoglobulin and sample it onto the alpha syn oligomer affinity gel column, then eluate the binding antibody to obtain the day. However, alpha syn oligomer antibody. The natural anti-alpha syn oligomer antibody prepared by this method has clear and specific targeting and easy to control dosage, so it can give full play to the therapeutic effect of the anti-alpha syn oligomer antibody, and has broad application prospects in the treatment of Parkinson's disease and other diseases related to alpha syn syn.

【技术实现步骤摘要】
一种天然α-syn寡聚体抗体的制备方法及其产品和应用
本专利技术属于生物
,涉及一种抗体的制备方法及其产品和应用,尤其涉及一种天然α-syn寡聚体抗体的制备方法及其产品和应用。
技术介绍
帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是发病率仅次于老年痴呆的一种神经退行性疾病,主要表现为震颤、肌强直、动作迟缓、姿势平衡障碍等运动症状和嗅觉减退、便秘、睡眠行为异常和抑郁等非运动症状。我国65岁以上人群总体患病率为1700/10万,并随年龄增长而升高,给家庭和社会都带来了沉重的负担。据估计目前世界上大约有1000万PD患者,尚无任何特异性治疗药物面世。因此,对PD有效治疗药物的研究刻不容缓。PD有两个主要的病理特征:一是患者大脑黑质部位多巴胺能神经细胞程序性死亡,在约70-80%多巴胺能神经细胞死亡后,就会出现临床症状;二是患者脑内有不溶性路易斯小体和Lewy神经突出现,其主要成分为聚集的α突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)。α-syn单体含有140个氨基酸,主要存在于前突触末端,可能与突触的可塑性有关。α-syn单体可聚集形成寡聚体、前纤维和纤维。在各种形式的α-syn聚集体中,寡聚体可能是最具有毒性的,是PD发生发展的主要致病因素。动物模型实验也证实α-syn基因的突变、错误剪切或过表达导致的α-syn聚集与PD的发生直接相关。脑内α-syn聚集体具有神经毒性,能够破坏神经细胞膜,导致活性氧自由基的大量产生,引起氧化应激,线粒体损伤,脂质和蛋白过氧化,钙平衡紊乱,炎症因子释放增加,最终导致神经细胞功能紊乱,甚至凋亡。这些病理变化进而使得病人和转基因动物的行为和认知功能发生明显衰退,加速PD的进程。大量研究也确认,PD的严重程度与病人和转基因动物脑内的α-syn聚集体水平密切相关。α-syn产生与清除之间的平衡被打破是PD病理学中的关键环节。基于α-syn的致病机理,对PD治疗药物的研究主要从三个方面入手:降低α-syn产生、抑制α-syn的聚集和加快α-syn的清除。基于α-syn的被动或主动免疫治疗是目前PD研究的热点。相对于主动免疫,被动免疫治疗具有更强的可控性,同时被动免疫不含T细胞表位,不会引起T细胞介导的脑膜炎,因而具有更好的安全性。针对α-syn的单克隆抗体有PRX002、BIIB-054、mAb4等,其中进展最快的是PRX002和BIIB-054,这两个抗体目前均已进入临床Ⅰ期试验。PRX002是一株人源化的针对聚集的α-syn的单克隆抗体,临床Ⅰ期试验结果表明该抗体具有较好的安全性和耐受性,经抗体治疗后病人血清中α-syn的浓度降低高达94%。BIIB-054是从健康老人的记忆B细胞中分离出来的全人源的单克隆抗体,该抗体可特异性靶向致病性的α-syn,与α-syn单体不结合,临床Ⅰ期试验结果表明该抗体也具有较好的安全性和耐受性。以上两种抗体均进入临床Π期,表明利用抗体治疗PD是可行的。静脉注射免疫球蛋白(IntravenousImmunoglobulin,IVIG)是从大量健康人群供体血浆中制备的免疫球蛋白混合物。自从1981年Imbach等偶然发现IVIG具有免疫调节作用以来,IVIG已被FDA批准用于免疫缺陷、自身免疫疾病及吉兰-巴雷综合症等神经紊乱疾病的治疗。Daniela等研究发现PD患者血液循环中的α-syn抗体水平明显降低,推测α-syn抗体水平可能与PD的发生发展相关。除了α-syn抗体水平,健康人中多种多样的天然抗α-syn抗体对防止PD的发生发展也十分重要。同时,该类天然抗体的种类及其之间的比例也是人工制备的α-syn相关抗体无法比拟的。但是IVIG中只含有微量抗α-syn寡聚体抗体,以IVIG治疗PD时,绝大多数的IVIG抗体都是无益的,其用量太高时,易导致副作用的发生,因而限制了IVIG对PD的治疗用量。CN107709361A公开了一种新颖的单克隆抗α-突触核蛋白抗体,可以使用这些抗体治疗突触核蛋白病,例如帕金森氏病(包括帕金森氏病的特发性和遗传性形式)、弥漫性路易体病、阿耳茨海默病的路易体变体、组合型阿耳茨海默和帕金森氏病、纯自主神经衰竭和多系统萎缩。CN105727285B公开了一种单克隆抗体在治疗神经退行性疾病中的应用。具体地,该专利技术提供了一种单克隆抗体的用途,用于制备治疗神经退行性疾病的药物组合物。实验证明,该专利技术的单克隆抗体和制剂对神经退行性疾病有显著的治疗作用,且该作用具有显著的剂量依赖性。CN104822389A公开了一种单克隆抗体5C1及其相关抗体。该5C1抗体结合到位于α突触核蛋白残基118~126内的表位。该专利技术的抗体可以用于治疗和/或诊断α突触核蛋白,尤其是α突触核蛋白聚集相关的紊乱。这些紊乱包括帕金森氏病,弥漫性路易体病、阿尔茨海默病路易体变异型,综合阿尔茨海默病和帕金森氏病,单纯性自主神经衰竭和多系统萎缩。以上抗α突触核蛋白的抗体均为人工型抗体,相对于天然抗体,其制备工艺复杂,操作难度大,因此,开发出一种天然α-syn寡聚体抗体的制备方法及其产品和应用是很有意义的。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题,本专利技术的目的在于提供一种抗体的制备方法及其产品和应用,尤其提供一种天然α-syn寡聚体抗体的制备方法及其产品和应用。为达到此专利技术目的,本专利技术采用以下技术方案:一方面,本专利技术提供一种天然α-syn寡聚体抗体(以下均用NAbs-α-syn来表示)的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:利用可装载蛋白的材料和交联的α-syn寡聚体制备得到含有α-syn寡聚体的亲和材料,将其作为洗脱柱的填料,将静脉注射免疫球蛋白(IntravenousImmunoglobulin,IVIG)稀释后上样于所述洗脱柱,然后用洗脱液将结合的抗体洗脱出来,得到NAbs-α-syn。健康人中多种多样的天然抗α-syn抗体对防止PD的发生发展十分重要,静脉注射免疫球蛋白就是其中一种,但静脉注射免疫球蛋白中只含有微量抗α-syn寡聚体抗体,以静脉注射免疫球蛋白治疗PD时,绝大多数的静脉注射免疫球蛋白抗体都是无益的,其用量太高时,易导致副作用的发生,因而限制了静脉注射免疫球蛋白对PD的治疗用量。而本专利技术将静脉注射免疫球蛋白中的α-syn的抗体提取出来治疗PD,可以减小静脉注射免疫球蛋白治疗时的副作用,增加抗体有效浓度,而且不影响余下静脉注射免疫球蛋白的使用。在本专利技术中,所述利用可装载蛋白的材料和交联的α-syn寡聚体制备含有α-syn寡聚体的亲和材料的方法为:(1)将可装载蛋白的材料加入至交联缓冲液中;(2)向步骤(1)得到的可装载蛋白的材料的体系中,加入交联的α-syn寡聚体,将所得到的混合体系进行离心处理,得到α-syn寡聚体亲和凝胶。在本专利技术中,所述可装载蛋白的材料包括但不限于聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶中的任意一种,优选聚丙烯酰胺凝胶。在本专利技术中,步骤(1)所述缓冲液为pH=10的含0.6M柠檬酸钠和0.2M碳酸钠的缓冲液。优选地,步骤(2)所述的离心处理包括以下步骤:A、将混合体系混匀,震荡,离心,弃液相;B、利用终止缓冲液进行重悬,震荡,离心,弃液相;C、利用PBS缓冲液进行重悬,震荡,离心,弃液相;D、利用NaCl溶液进本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种天然α‑syn寡聚体抗体的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:利用可装载蛋白的材料和交联的α‑syn寡聚体制备得到含有α‑syn寡聚体的亲和材料,将其作为洗脱柱的填料,将静脉注射免疫球蛋白稀释后上样于所述洗脱柱,然后用洗脱液将结合的抗体洗脱出来,得到天然α‑syn寡聚体抗体。

【技术特征摘要】
1.一种天然α-syn寡聚体抗体的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:利用可装载蛋白的材料和交联的α-syn寡聚体制备得到含有α-syn寡聚体的亲和材料,将其作为洗脱柱的填料,将静脉注射免疫球蛋白稀释后上样于所述洗脱柱,然后用洗脱液将结合的抗体洗脱出来,得到天然α-syn寡聚体抗体。2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述利用可装载蛋白的材料和交联的α-syn寡聚体制备含有α-syn寡聚体的亲和材料的方法为:(1)将可装载蛋白的材料加入至交联缓冲液中;(2)向步骤(1)得到的可装载蛋白的材料的体系中,加入交联的α-syn寡聚体,将所得到的混合体系进行离心处理,得到α-syn寡聚体亲和凝胶。3.如权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,所述可装载蛋白的材料为聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶中的任意一种,优选聚丙烯酰胺凝胶;优选地,步骤(1)所述缓冲液为pH=10的含0.6M柠檬酸钠和0.2M碳酸钠的缓冲液;优选地,步骤(2)所述的离心处理包括以下步骤:A、将混合体系混匀,震荡,离心,弃液相,B、利用终止缓冲液进行重悬,震荡,离心,弃液相;C、利用PBS缓冲液进行重悬,震荡,离心,弃液相;D、利用NaCl溶液进行重悬,震荡,离心,弃液相;E、利用PBS缓冲液进行重悬,震荡,离心,弃液相;优选地,步骤A所述震荡时间为0.5-2h;优选地,步骤A所述离心时间为0.5-5min;优选地,步骤A所述离心力大小为1000-3000g。4.如权利要求1-3中任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤B所述缓冲液为pH=9.0的含3.0MNH2(CH2)2OH的缓冲液;优选地,步骤B所述震荡时间为1-5h;优选地,步骤B所述离心时间为0.5-5min;优选地,步骤B所述离心力大小为1000-3000g。5.如权利要求1-4中任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤C所述震荡时间为5-60min;优选地,步骤C所述离心时间为0.5-5min;优选地,步骤C所述离心力大小为1000-3000g;优选地,步骤D所述NaCl溶液的浓度为1M;优选地,步骤D所述震荡时间为5-60min;优选地,步骤D所述离心时间为0.5-5min;优选地,步骤D所述离心力大小为1000-3000g;优选地,步骤E共重复进...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘瑞田黄亚茹谢喜秀
申请(专利权)人:中国科学院过程工程研究所
类型:发明
国别省市:北京,11

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