一种转基因油菜T45的RPA检测引物与探针组合、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种转基因油菜T45的RPA检测引物与探针组合、试剂盒及检测方法。引物组由2条特异性引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID No：1～2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。检测试剂盒包括检测引物与探针溶液、Buffer A、Buffer B和阳性对照。检测方法是采用特异性引物及探针在重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)、链置换DNA聚合酶和核酸外切酶的作用下，在37～42℃对样品DNA模板进行扩增，通过对探针荧光信号收集的方法，判断样品是否含有转基因油菜T45成分。本发明专利技术不需要特殊仪器，具有快速高效、操作简便、灵敏度高、特异性强等特点，适合现场检测。

A combination of primers and probes, kit and detection method for RPA detection of T45 in transgenic rapeseed

The invention discloses a combination of RPA detection primers and probes, a kit and a detection method for T45 of genetically modified rapeseed. The primer group consisted of two specific primers. The nucleotide sequence was shown as SEQ ID No:1-2 and the probe sequence was shown as SEQ ID No.3. The detection kit included detection primers and probe solutions, Buffer A, Buffer B and positive controls. Specific primers and probes were used to amplify the DNA template of the sample at 37-42 C under the action of recombinant enzyme, single-stranded DNA binding protein (SSB), strand displacement DNA polymerase and nucleic acid exonuclease. By collecting the fluorescent signal of the probe, the samples were judged to contain the T45 component of transgenic rape. The invention does not need special instruments, has the characteristics of fast, high efficiency, simple operation, high sensitivity and strong specificity, and is suitable for on-site detection.

【技术实现步骤摘要】
一种转基因油菜T45的RPA检测引物与探针组合、试剂盒及检测方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及一种利用重组酶聚合酶扩增技术(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)快速检测转基因油菜T45的引物与探针组合、试剂盒和检测方法。
技术介绍
2016年全球转基因作物种植面积高达1.851亿公顷，比1996年商业化初期增长了100余倍。目前商业化种植的转基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜。转基因油菜T45是拜耳公司研发的一种耐除草剂转基因油菜，已被我国批准进口用作加工原料。针对转基因油菜T45开展快速精准的检测方法研究，是转基因生物安全管理相关法律法规顺利实施的技术支撑和保障。转基因成分检测技术主要分为两大类：一类以外源DNA为检测对象，如PCR、基因芯片等，另一类以外源基因表达的蛋白质为检测对象，如ELISA、免疫试纸条等。在上述方法中，目前PCR技术应用最为广泛，但基于PCR的转基因检测方法需要PCR仪、凝胶成像系统等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长(约3～4h)，难以达到现场快速检测目的，因此，在实际工作中需要一种更加便捷、准确、且适用于现场操作的转基因检测新技术。RPA技术是一种新型的基因扩增技术，主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应并在链置换DNA聚合酶作用下启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增，被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。该技术的基本特点是：①恒温扩增：整个扩增反应在恒温条件(37～42℃)进行，不需要特殊仪器设备；②快速高效：整个扩增和产物检测可在30分钟内完成；③高特异性：重组酶与引物形成复合体，特异的寻找靶标序列，再加上探针的特异识别与信号收集，扩增特异性高；④高灵敏度：检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便：通过扩增荧光曲线的有无，对扩增产物进行便捷的检测。RPA方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因植物检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用RPA方法检测转基因油菜T45的检测方法和试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提供一种RPA检测转基因油菜T45的引物和探针，以及一种能快速、简便、特异的检测转基因油菜T45的方法和试剂盒。本专利技术具体通过以下技术方案实现：根据转基因油菜T45的转化体特异性的核苷酸序列，设计转基因油菜T45的RPA检测引物，所述的引物包括正向引物F和反向引物R，其核苷酸序列具体如下所示：正向引物F：AGATTTTCTTCTTGTCATTGAGTCGTAAGA(SEQIDNO：1)；反向引物R：AAACCATAAGCAAATCGGTTTATTCTCTAC(SEQIDNO：2)；上述引物在RPA检测转基因油菜T45种质资源中的应用。本申请另一方面提供了RPA检测转基因油菜T45种质资源的探针，该探针与上述引物配合使用，所述的探针核苷酸序列为：P：CCATGGGAATTCATTTACAACTGTATTCCA[FAM-dT]AT[THF]CA[BHQ1-dT]AATTCATGTGTC-C3-Spacer(SEQIDNO：3)。一种转基因油菜T45的RPA检测试剂盒，包括上述正向引物F、反向引物R和探针P。所述的RPA检测试剂盒具体包括以下组分：1)检测引物与探针溶液：正向引物F(10μmol/L)，反向引物R(10μmol/L)，探针P(10μmol/L)；2)BufferA：包含50mmol/LTris-HCl、pH8.4，80mmol/LKAc，2mmol/LDTT，3mmol/LATP，200μmol/LdNTPs，20mmol/LC4H10N3O5P，100ng/μLcreatinekinase，5％20mol/LPEG，600ng/μLSSB，125ng/μLuvsX，25ng/μLuvxY，30ng/μLBsu和96ng/μLExoⅢ；3)BufferB：10mmol/LMgAc；4)阳性对照，转基因油菜T45粉末(含量为0.1％)。在上述试剂盒的基础上，本专利技术另一方面公布了一种转基因油菜T45的RPA检测方法，具体包括以下步骤：1)提取待测样品的基因组DNA；2)配制待测样品的RPA检测反应体系：在200μLPCR反应管内加入模板DNA2μL、检测正反引物溶液各1μL、探针溶液0.5μL、BufferA溶液23.5μL、BufferB溶液2μL，总体积为30μL；3)运行RPA扩增与结果判断：将PCR反应管置于荧光检测仪中，37～42℃孵育20min，根据荧光曲线扩增的有无，实时分析扩增结果。本专利技术的有益效果：本专利技术基于重组酶聚合酶扩增技术检测转基因油菜T45种质资源，通过实验证明，本专利技术提供的转基因油菜T45的RPA检测引物与探针组合、试剂盒及检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强等优点。附图说明图1是本专利技术实施例4中进行特异性和灵敏度检测的结果图。具体实施方式下面将结合本专利技术具体的实施例，对本专利技术技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1转基因油菜T45RPA检测引物和探针的设计及筛选本专利技术中T45RPA检测的目标区域为T45的转化体特异性序列，即外源插入片段与油菜基因组的连接区序列，其中的正反向引物分别位于连接点的两侧，而探针则覆盖了连接区域。(1)引物设计分别在连接点的两侧各设计5条引物，引物长度为30-32bp,本专利技术筛选引物序列如下：F1:AGATTTTCTTCTTGTCATTGAGTCGTAAGA；F2:GACTCTGTATGAACTGTTCGCCAGTCTTTA；F3:CGGCGAGTTCTGTTAGGTCCTCTATTTGAA；F4:AGTCGTAAGAGACTCTGTATGAACTGTTCG；F5:CCAGTCTTTACGGCGAGTTCTGTTAGGTCC；R1:ACAGAGATATATATGACAACACGACAATAT；R2:AAACCATAAGCAAATCGGTTTATTCTCTAC；R3:ATTACATGAAATCTAAATATCTTGAAGTAT；R4:TTTGAATGATAAAATAAGGGGTAAAATCAA；R5:CCATAAGCAAATCGGTTTATTCTCTACATT。(2)探针设计设计原则：探针序列覆盖连接区域，探针的长度为46-52bp，在中间相距1-5个碱基的胸腺嘧啶(T)上分别标记荧光基团，在5’端T上标记荧光基团(如FAM)，在3’端T上标记猝灭基团(如BHQ1)，在两个荧光基团的中间位本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因油菜T45的RPA检测引物，其特征在于，所述的引物包括正向引物F和反向引物R，所述的正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种转基因油菜T45的RPA检测引物，其特征在于，所述的引物包括正向引物F和反向引物R，所述的正向引物F的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的反向引物R的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.权利要求1所述的RPA检测引物在检测转基因油菜T45种质资源中的应用。3.一种RPA检测转基因油菜T45种质资源的探针，其特征在于，所述的探针与权利要求1所述的引物配合使用，所述的探针核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.一种转基因油菜T45的RPA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的正向引物F和反向引物R。5.根据权利要求4所述的一种转基因油菜T45的RPA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的探针。6.一种转基因油菜T45的RPA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待测样品的基因组DNA；2)配制待测样品的RPA检测反应体系：在200μLPCR反应管内加入模板DNA2μL、检测正反引物溶液各1μL、探针溶液0....

【专利技术属性】
技术研发人员：陈笑芸，徐俊锋，汪小福，彭城，徐晓丽，魏巍，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33