通过增加天然类胡萝卜素发酵过程中溶氧生产天然类胡萝卜素的方法技术

本发明专利技术提供了一种通过增加天然类胡萝卜素发酵过程中溶氧生产天然类胡萝卜素的方法，所述方法将植物油脂通过化学方法或酶法进行适度改性，得到改性植物油脂，随后利用得到的改性植物油脂作为微生物发酵的碳源与培养基通过胶体磨高速剪切混合。发酵完成后最终发酵液中β‑胡萝卜素单位最高可达13.5g/l。发酵完成后调节发酵液pH使细胞破壁，用有机溶剂提取胞内类胡萝卜素，浓缩后结晶就可得高纯度的类胡萝卜素晶体，不需其它的精制分离步骤，其中类胡萝卜素的含量可达96％以上，提取收率在85％左右。在整个生产过程中操作简便，类胡萝卜素素的损失少，杂质少，产率高，易于工业化生产。

Method of Producing Natural Carotenoids by Increasing Dissolved Oxygen in the Fermentation of Natural Carotenoids

The invention provides a method for producing natural carotenoids by increasing dissolved oxygen in the process of natural carotenoid fermentation. The method modifies vegetable oils by chemical or enzymatic methods to obtain modified vegetable oils, and then uses the obtained modified vegetable oils as carbon source for microbial fermentation and mixes them with the culture medium by colloid mill at high speed. After the fermentation, the maximum beta carotene unit in the final fermentation broth can reach 13.5 g/l. After fermentation, the cell wall was broken by adjusting the pH of fermentation broth. The intracellular carotenoids were extracted with organic solvents. After concentration and crystallization, high purity carotenoid crystals could be obtained without other refinement and separation steps. The content of carotenoids could reach more than 96% and the yield was about 85%. In the whole production process, it is easy to operate, less loss of carotenoids, less impurities, high yield and easy to industrialize.

【技术实现步骤摘要】
通过增加天然类胡萝卜素发酵过程中溶氧生产天然类胡萝卜素的方法
本专利技术涉及利用微生物发酵生产β-胡萝卜素和番茄红素，包括通过改性植物油增强发酵过程中溶氧的措施，属生物化工领域。本专利技术涉及到以较高的收率通过微生物发酵并经提取纯化生产天然类胡萝卜素的方法，其中应用到改性植物油增强培养基中溶氧，从而使微生物利用氧的效率得到极大提升，最终高收率地得到天然类胡萝卜素。专利技术背景类胡萝卜素是自然界中发现最多且分布广泛的一类色素物质，类胡萝卜素化合物广泛应用于食品、化妆品、药品等的着色，近年来研究发现类胡萝卜素对预防、延缓和治疗某些疾病，提高机体免疫力方面具有较好的疗效。其中，β‐胡萝卜素是一种重要的类胡萝卜素，其化学式C40H56，分子量536.88，由四个异戊二烯双键首尾相连而成，主要由全反式、9-顺式、13-顺式及15顺式四种形式，分子结构式如下：在其分子结构的两端各有一个β-紫罗兰酮环，此β-紫罗兰酮可能以异构性、取代型、开环型的形式存在。β-胡萝卜素具有重要的生理功能，可以作为维生素A的前体，是联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会认定的A类营养食品强化剂。有研究表明β-胡萝卜素作为维生素A的前体具有抗氧化、影响繁殖和甲状腺功能等作用。β-胡萝卜素分子中的多个双键，在光、热、氧气及活泼性较强的自由基离子存在下，易被氧化，从而起到抗氧化的作用，保护机体不被破坏。除此之外，研究还表明β-胡萝卜素还具有增强免疫力，提高人体抗癌能力；促进细胞间的连接与交流；抗尼古丁作用等。β-胡萝卜素有全化学合成和天然来源。全化学合成法得到的β-胡萝卜素由于可能存在着一些化学中间体杂质，近来年，人们越来越偏向于天然来源的β-胡萝卜素，而天然来源的β-胡萝卜素往往又有三种生产方法，分别是从天然植物中提取，通过盐藻养殖得到以及通过微生物发酵法生产。通过从胡萝卜等含微量β-胡萝卜素蔬菜中提取、分离，可获得一定量的天然β-胡萝卜素，采用这种方法生产的不足很显然是耗费原料多，产量低。第二种方法是通过大面积养殖盐藻获得，如大面积养殖杜氏盐藻，通过溶剂萃取法获得，但是盐藻养殖受外界环境条件的严格限制，使其规模很难壮大，远远不能满足市场需求。第三种方法是通过微生物发酵法生产，采用这种方法生产天然β-胡萝卜素因不受环境条件限制，产量高，易于实现工业化生产而受到重视，有越来越多的研究机构和生产厂家投入到这方面的研究中去。国内外用于生产天然β-胡萝卜素的微生物菌种主要有分支杆菌、红酵母等，但应用最为广泛的还是丝状真菌，如三孢布拉霉、好食脉孢霉等，其中又以三孢布拉霉应用为多。应用三孢布拉霉发酵生产天然β-胡萝卜素的过程中，通过代谢调节剂的调节作用，可以用同一菌株生产天然番茄红素。因为番茄红素与β-胡萝卜素有相同的分子式和分子量，只是其分子结构式两端没有被环化。应用三孢布拉霉生产天然β-胡萝卜素或番茄红素一般是通过其两种菌株如(+)和(-)菌株进行混合发酵生产的，其具体的代谢途径在先前文献WO00/77234,CagliotiL.etal.(1966)中有较为详尽的描述，在近阶段的研究中主要集中于如何改变发酵条件或添加前体物质以提高发酵单位，以及如何有效地从发酵菌丝体中分离得到高质量的β-胡萝卜素或番茄红素纯品。较多的专利文献中有这方面的报道，并提出了很多改进措施，但这些措施或者生产工艺中往往存在着这样或那样的技术缺陷，或者由于发酵单位低以至成本高，不利于工业化生产；或者没有采用合适的方法，不仅使提取纯化β-胡萝卜素的工艺复杂，而且使发酵得到的胞内产物不易被提取完全；或者在提取纯化过程中用到毒性较大的有机溶剂，存在食用安全风险；或者得到的β-胡萝卜素或番茄红素含量不高，存在较多的杂质。利用丝状真菌三孢布拉霉发酵生产天然β-胡萝卜素和番茄红素过程中一个重要且需优化的问题就是解决其溶氧问题。由于三孢布拉霉发酵为有氧发酵，过程中需要大量的氧气，氧气浓度越高越有利于菌丝体生长，从而提高菌液浓度和发酵产率。但由于天然β-胡萝卜素和番茄红素为类胡萝卜素，其分子结构中存在着11个双键，对氧特别不稳定，大量氧气的存在会使部分产生的β-胡萝卜素和番茄红素氧化降解，不仅降低了最终产物收率，而且β-胡萝卜素和番茄红素降解后生成了许多杂质，这些杂质的存在会使后续β-胡萝卜素和番茄红素的分离过程变得更加复杂，使精制纯化步骤延长，降低了终产品收率的同时，得到的β-胡萝卜素和番茄红素晶体纯度也不高。而且，在常规的应用三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素和番茄红素的过程中，往往是利用天然植物油脂如大豆油、菜籽油、棉籽油、玉米油作为供发酵过程菌体利用的主要碳源物质，植物油脂被菌体分解后生成各种脂肪酸、甘油为三孢布拉霉合成提供代谢中间体。为了使菌体更好地生长，植物油脂的添加量还较大。但植物油脂为脂溶性的，水溶性基质的发酵培养基中大量脂溶性植物油脂的存在会使氧在其中的熔解度大为降低，同时会降低菌丝体利用氧的效率。所以在应用三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素和番茄红素的过程中，大量植物油脂的使用与发酵培养基中氧浓度是一对矛盾，三孢布拉霉的生长需要大量的植物油脂和氧气，但植物油脂会的存在使氧气在培养基中的溶解困难，微生物利用培养基中溶解氧的效率也降低了。为了解决这一问题，常规工业上的方法就是在加入大量植物油脂的同时，通过加快搅拌速度，强制通入高纯氧气等措施来加大氧在培养基中的溶解度，但过快的搅拌速度会使部分菌丝体断裂，从而阻止了其生长，另外，大量高纯氧气中只有少部分被微生物所利用，其余大量的高纯氧气会使部分生产的β-胡萝卜素和番茄红素降解，产生大量杂质，不仅导致终产品收率不高，而且增大了后续分离纯化难度。U.S.Patent3,752,740通过在培养基中添加7.5％的柠檬酸，应用三孢布拉霉发酵生产天然β-胡萝卜素，但最终发酵液中发酵单位很低，不适于工业化生产。U.S.Patent7,252,965中公开了对三孢布拉霉的筛选优化，并在发酵过程中通过添加前体物质β-紫罗兰酮和强制增大溶解氧等措施以增加发酵液中β-胡萝卜素的产量，此工艺中通过强制增加溶解氧提高β-胡萝卜素产量的结果也并不十分理想，而且由于大量氧气的引入，使部分类胡萝卜素发生降解，后续分离纯化过程复杂。EP1,306,444B1中涉及一种应用三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素并从菌丝体中提取β-胡萝卜素的方法。在发酵过程中需要添加卵磷脂及分阶段调节发酵液pH，而在提取纯化β-胡萝卜素过程中要经历多个步骤如醇类精制过滤后的菌丝体，干燥并粉碎菌丝体，有机溶剂萃取，浓缩浸提后的有机溶剂，加醇类溶剂结晶，过滤并干燥等。此工艺特别是β-胡萝卜素的提取纯化方法十分复杂繁琐，要涉及至少三次干燥和粉碎步骤，分别为精制后湿菌丝体干燥和粉碎，提取后β-胡萝卜素纯品干燥及粉碎及β-胡萝卜素提取完成后菌丝体残渣的干燥。同样也就必然涉及到三次粉状物料的转移过程，这在工业化生产中会带来一系列设备和技术上的额外要求，而且两次受热干燥过程对β-胡萝卜素这种受热时不稳定的物质来说是十分不利的，会使最终产物的收率降低。另外，菌丝体的粉碎过程一方面会增加工序，另一方面粉碎过程产生的微粉对职业健康来说也是不利的。总之，这些先前技术中往往没有考虑到作为营养碳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过增加天然类胡萝卜素发酵过程中溶氧生产天然类胡萝卜素的方法，所述方法包括以下步骤：a)将植物油通过化学方法或酶法进行改性，得到HLB＝2.0‑3.5的改性植物油脂；b)培养基中加入a)中所述的改性植物油脂，通过胶体磨高速剪切乳化混合，得到含有改性植物油脂的培养基；c)利用b)中得到的培养基接种三孢布拉霉发酵生产天然类胡萝卜素，提取、分离、烘干得到天然类胡萝卜素纯品。

【技术特征摘要】
1.一种通过增加天然类胡萝卜素发酵过程中溶氧生产天然类胡萝卜素的方法，所述方法包括以下步骤：a)将植物油通过化学方法或酶法进行改性，得到HLB＝2.0-3.5的改性植物油脂；b)培养基中加入a)中所述的改性植物油脂，通过胶体磨高速剪切乳化混合，得到含有改性植物油脂的培养基；c)利用b)中得到的培养基接种三孢布拉霉发酵生产天然类胡萝卜素，提取、分离、烘干得到天然类胡萝卜素纯品。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述天然类胡萝卜素包括β‐胡萝卜素和番茄红素。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述植物油为大...

【专利技术属性】
技术研发人员：许新德，邵斌，张莉华，孙新强，
申请(专利权)人：浙江医药股份有限公司新昌制药厂，
类型：发明
国别省市：浙江,33