羊乳寡糖测定方法技术

技术编号:20220473 阅读:49 留言:0更新日期:2019-01-28 19:25
本发明专利技术公开了一种羊乳寡糖测定方法,包括以下步骤:步骤一、对羊乳脱脂、脱蛋白得羊乳寡糖粗品;步骤二、利用Sephadex‑G10凝胶柱除乳糖,得到羊乳寡糖样品;步骤三、利用Carbo Pac

【技术实现步骤摘要】
羊乳寡糖测定方法
本专利技术涉及一种羊乳寡糖分离及测定方法。
技术介绍
乳是一种复杂的营养成分包括脂肪、蛋白质、碳水化合物,其中乳也提供了哺乳动物的营养需要。在碳水化合物中乳糖的含量超过80%,而游离乳寡糖含量占总糖的4%左右,因此乳糖的去除对于乳寡糖的分析产生了重要的作用。研究证明,乳寡糖可以平衡肠道微生物群以调节免疫系统,唾液酸化的寡糖可以促进脑发育,并且作为半乳糖的来源用于合成半乳糖脑苷脂,唾液酸用于脑灰质中的神经节苷脂以及糖蛋白产生。研究发现,人乳中含有200余种低聚糖,然而,由于大小,电荷和结构的差异性,迄今为止,只有低分子量的人乳低聚糖可以通过化学方法合成。因此,寻找具有类似于人乳低聚糖生物活性的替代来源并应用于婴儿配方食品已引起人们的关注。羊乳是婴幼儿配方粉的重要乳基料之一,有研究表明羊乳中低聚糖含量约为0.25-0.30g/L,是牛乳低聚糖含量的8倍左右,是潜在的母乳低聚糖替代物。但由于检测方法的限制及技术壁垒,我国羊乳中低聚糖结构的研究较为落后,因此建立有效的羊乳低聚糖检测手段对我国羊乳低聚糖研究具有重要意义。基于这些生理功能,人们开始关注于乳寡糖的研究。国内对于羊乳寡糖结构的研究鲜有报道,且并没有一个羊乳寡糖的检测方法。低聚糖的分离和纯化是低聚糖检测的关键,因其自身组成、连接、衍生化、微观不均一性等方面的高度复杂性,使其监测具有很大困难。在对羊乳中的低聚糖进行分析时,一些高丰度的低聚糖会遮盖低丰度低聚糖的检测信号,阻碍了低聚糖的完全鉴定,这就需要对低聚糖样品进行富集纯化操作,减少杂质的混合,提高检测的灵敏度。由于羊乳中乳糖含量较高,而低聚糖的含量较低,分离低含量成分的难度很大,另一个方面,羊乳中寡糖的单糖个数一般为3-10之间,分子量相近,更是增加了操作难度,同时,同分异构体的保留时间和质谱图又非常相似,给定性带来很大困难。因此选择合适的方法,对羊乳寡糖进行分离并测定,是一项探索性很强的工作。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题,并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种羊乳寡糖测定方法,通过凝胶柱层析,实现了对低聚糖测定影响物质乳糖的有效去除,获得羊乳寡糖样品,随后利用高效阴离子交换色谱对乳糖去除率及低聚糖保留率进行定量分析,利用超高效液相Q-ExactiveFocus质谱对羊乳低聚糖进行鉴定,通过对液相条件的优化实现了对羊乳寡糖同分异构体的定性及定量分析。采用本专利技术所述测定方法,最终鉴定出了49种羊乳寡糖并实现了对该49种羊乳寡糖结构组成的分析,分离效果好,且样品无需衍生化,保留了寡糖的原始结构,另外操作过程简单,结果稳定,重复性好。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点,提供了一种羊乳寡糖测定方法,包括以下步骤:步骤一、对羊乳脱脂、脱蛋白,提取羊乳寡糖粗品;步骤二、对所述羊乳寡糖粗品利用Sephadex-G10凝胶柱除乳糖,得到羊乳寡糖样品;步骤三、利用CarboPacTMPA20糖分离柱对所述羊乳寡糖样品的乳糖脱除率及低聚糖保留率进行测定;步骤四、优化液相条件并采用超高效液相Q-ExactiveFocus质谱对所述羊乳寡糖样品的成分及结构进行定性及定量分析。优选的是,所述步骤一中,羊乳脱脂、脱蛋白的具体方法为:取羊乳在3~8℃、8000~10000rpm条件下离心15~30min,去除上层的脂肪和底部少量的蛋白质,取出中间层按体积比1:2~1:6的比例加入无水乙醇,温度为-80~4℃下反应2~12h,反应结束后在3~8℃下4000×g离心15~30min,取上清液,干燥,得到所述羊乳寡糖粗品。优选的是,所述干燥采用真空浓缩仪浓缩干燥。优选的是,所述步骤二中,除乳糖的具体方法包括:首先将Sephadex-G10凝胶放置在烧杯中用超纯水浸泡10~15h,真空泵除气泡1~2h后加入层析柱中,所述层析柱的规格为1.6×60cm,然后使用超纯水在流速为2.5~3mL/min下预压12h;将所述羊乳寡糖粗品上样到Sephadex-G10凝胶柱中,采用超纯水为洗脱液,流速为2~2.5mL/min,利用自动收集器每2min收集一次过柱液体,所述过柱液体经苯酚-硫酸法检测,置于-80℃冰箱中备用。优选的是,其特征在于,所述步骤三中,测定乳糖脱除率及低聚糖保留率的具体方法为:采用超纯水作为流动相A,250mMNaOH作为流动相B,柱温为35℃,以0.4mL/min的流速对所述羊乳寡糖样品进行梯度洗脱,梯度洗脱的条件:0-40.1min,7.2%-100%A;40.2-45min,100%-100%A;45.1-55min,100%-7.2%A;剩余液相部分为流动相B。采用金电极脉冲安培检测器,检测样品中乳糖含量,并收集含有羊乳寡糖的收集管。优选的是,所述步骤四中,超高效液相Q-ExactiveFocus质谱的液相条件为:采用ACQUITYUPLC氨基色谱柱,色谱柱规格2.1mm×100mm,柱填料粒径为1.5~2μm,柱温30~40℃,流速0.2~0.5mL/min,流动相A为乙腈,流动相B为10mM甲酸铵,梯度洗脱的条件为:0-20min,95%-78%A;20-35min,78%-73%A;35-38min,73-62%A;38-45min,62%-50%A;45-55min,50%-95%A;55-65min,95%-95%A;液相剩余部分为流动相B。优选的是,所述步骤四中,超高效液相Q-ExactiveFocus质谱的质谱条件为:电喷雾离子源:正离子模式和负离子模式喷雾电压均为5~20kV。一级离子的质量扫描范围300--2000m/z,柱温为30~40℃。本专利技术至少包括以下有益效果:本专利技术利用Sephadex-G10凝胶柱对已脱脂和脱蛋白的羊乳进行分离纯化,有效去除影响物质乳糖,再通过液相条件的优化对低聚糖同分异构体进行定性及定量分析,最后通过质谱仪器的合理设定,鉴定出了羊乳中49种羊乳寡糖成分,并实现了对该49种羊乳寡糖结构的分析。本专利技术测定方法简单可行,结果稳定,可用于羊乳寡糖的纯化分离和测定。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术实施例1中羊乳寡糖样品的总离子流图。图2为本专利技术实施例1中羊乳寡糖样品中Hex2Neu5Ac1的异构体的总离子流图。图3为本专利技术实施例2中羊乳寡糖样品的总离子流图。图4为本专利技术实施例2中羊乳寡糖样品中Hex2Neu5Ac1的异构体的总离子流图。图5为本专利技术实施例3中羊乳寡糖样品的总离子流图。图6为本专利技术实施例3中羊乳寡糖样品中Hex2Neu5Ac1的异构体的总离子流图。图7为本专利技术实施例3中羊乳寡糖粗品的离子色谱图。图8为本专利技术实施例3中羊乳寡糖样品的离子色谱图。图9为对比例1中羊乳寡糖样品的离子色谱图。图10为对比例2中羊乳寡糖样品的离子色谱图。图11为对比例3中羊乳寡糖样品的离子色谱图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。本专利技术所述羊乳寡糖测定方法,包括本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.羊乳寡糖测定方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一、对羊乳脱脂、脱蛋白,提取羊乳寡糖粗品;步骤二、对所述羊乳寡糖粗品利用Sephadex‑G10凝胶柱除乳糖,得到羊乳寡糖样品;步骤三、利用Carbo PacTMPA20糖分离柱对所述羊乳寡糖样品的乳糖脱除率及低聚糖保留率进行测定;步骤四、优化液相条件并采用超高效液相Q‑Exactive Focus质谱对所述羊乳寡糖样品的成分及结构进行定性及定量分析。

【技术特征摘要】
1.羊乳寡糖测定方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一、对羊乳脱脂、脱蛋白,提取羊乳寡糖粗品;步骤二、对所述羊乳寡糖粗品利用Sephadex-G10凝胶柱除乳糖,得到羊乳寡糖样品;步骤三、利用CarboPacTMPA20糖分离柱对所述羊乳寡糖样品的乳糖脱除率及低聚糖保留率进行测定;步骤四、优化液相条件并采用超高效液相Q-ExactiveFocus质谱对所述羊乳寡糖样品的成分及结构进行定性及定量分析。2.如权利要求1所述的羊乳寡糖测定方法,其特征在于,所述步骤一中,羊乳脱脂、脱蛋白的具体方法为:取羊乳在3~8℃、8000~10000rpm条件下离心15~30min,去除上层的脂肪和底部少量的蛋白质,取出中间层按体积比1:2~1:6的比例加入无水乙醇,温度为-80~4℃下反应2~12h,反应结束后在3~8℃下4000×g离心15~30min,取上清液,干燥,得到所述羊乳寡糖粗品。3.如权利要求2所述的羊乳寡糖测定方法,其特征在于,所述干燥采用真空浓缩仪浓缩干燥。4.如权利要求1所述的羊乳寡糖测定方法,其特征在于,所述步骤二中,除乳糖的具体方法包括:2.1)首先将Sephadex-G10凝胶放置在烧杯中用超纯水浸泡10~15h,真空泵除气泡1~2h后加入层析柱中,所述层析柱的规格为1.6×60cm,然后使用超纯水在流速为2.5~3mL/min下预压12h;2.2)将所述羊乳寡糖粗品上样到Sephadex-G10凝胶柱中,采用超纯水为洗脱液,流速为2~2.5mL/min,利用自动收集器每2min收集一次过柱液体,所述过柱液体经苯...

【专利技术属性】
技术研发人员:芦晶吕加平张艳张书文逄晓阳
申请(专利权)人:中国农业科学院农产品加工研究所
类型:发明
国别省市:北京,11

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